电化学免疫传感器在肿瘤标志物检测中的应用研究

电化学免疫传感器在肿瘤标志物检测中的应用研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-12-24 分类:期刊论文 喜欢:4019
师大云端图书馆

【摘要】癌症,仍是人类主要的死亡原因。虽然恶性肿瘤的治疗技术在不断进步,但迄今为止,恶性肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗仍然是治疗恶性肿瘤最有效的手段。从筛选的角度来讲,早期诊断癌症的最有效的方法是通过血液检查,寻找肿瘤标志。随着生物学技术的发展及研究的深入,人们发现许多肿瘤早期标志物的一个最显著的特点是其在血清中浓度非常低。传统的检测肿瘤标记物的方法,如:ELISA、放射免疫和荧光免疫法等,具有操作时间长,辐射及光污染严重,且灵敏度不够高等缺点。近年来发展起来的化学发光免疫检测和电化学发光免疫检测以及蛋白芯片技术则进一步推动了临床检测技术的发展,但它们本身还存在一定的缺点有待于进一步解决。因此,发展高灵敏的免疫分析技术对于肿瘤标志物的检测有着至关重要的意义。生物传感器的崛起使免疫测定技术有了一次大的飞跃,电化学免疫传感器是利用抗原和抗体间的高度特异性结合的原理,将免疫分析法和电化学传感技术相结合构建而成的一项新方法,因为传感器具有灵敏度高、分析速度快、操作简便、低成本、低能耗等特点,被广泛应用于临床诊断领域,并逐渐成为非常有潜力的检测技术之一。现今,基于免疫分析法结合免疫传感器的研制成为检测肿瘤标志物的研究新兴技术。大量研究用于研发操作简便易行的传感器。尽管这个领域的很多技术已经具有很多优势,但是寻求一种更加简便,灵敏度更高,选择性更好的检测方法仍然是现代医学检验和生物医学研究领域的研究热点。本论文以肝癌血清标志物—甲胎蛋白为检测对象,构建了种具有高灵敏性的电化学免疫传感器,并对其临床结果进行了初步评价,主要内容如下:1.成功构建了一种基于单抗多抗夹心体系的高灵敏、制备简单的便携式多通量电化学免疫传感阵列并用于AFP定量检测。采用物理吸附的方法将捕获探针抗体固定在印刷电极芯片上,用更简单的方法得到了比共价耦联更好的抗体组装效率及抗体组装量。随后在靶蛋白和信号探针及多克隆抗体分别反应后,酶标二抗就可以连接,利用便携式多通道电化学仪检测辣根过氧化物酶催化底物的氧化还原电流就可以实现检测。在此基础上,又引入了Poly-HRP放大技术,将标记有羊抗兔IgG的超分子多聚HRP酶复合物作为信号的载体,可有效增强免疫反应电流响应的信号,提高了传感器的检测灵敏度。实验结果对AFP检测限达到56pg/ml,同时有两个线性范围,低浓度区间为64p-1000p,高浓度区间为1n-250n。该传感器具有灵敏度高、线性范围宽等特点,实现了微量AFP的定量检测。表明该传感器在HCC的诊断及AFP检测方面具有进一步的应用前景。2.成功构建了一种基于双单抗多抗夹心体系的灵敏度高、制备简单的便携式多通量电化学免疫传感阵列并用于血清中AFP的定量检测。不仅降低了背景,同时进一步提高了检测灵敏度。在此工作中,将捕获探针单抗通过简单的物理吸附固定在印刷电极芯片上,靶蛋白和信号探针及生物素化的单抗分别反应后,链霉亲和素(streptavidin)-HRP通过与生物素亲和连接在印刷电极表面,利用便携式多通道电化学仪检测辣根过氧化物酶催化底物的氧化还原电流就可以进行检测。在此基础上,又再引入了Poly-HRP放大技术,将标记有streptavidin的超分子多聚HRP酶复合物作为信号放大的载体,可有效增强免疫反应电流响应信号,提高传感器的检测灵敏度。对AFP检测限达至34pg/ml,同时有两个线性检测范围,低浓度区间为64p-1000p,高浓度区间为1n-500n.而目前多应用的一般ELISA试剂盒检测限仅为ng/ml级别。电化学发光法的检测限也只为605pg/ml。该免疫传感器具有良好的重现性,特异性和稳定性。将该免疫传感器用于人血清中AFP的检测,并与ELISA法的检测结果比较,结果表明该免疫传感器与经典的ELISA法的测定结果具有良好相关性。表明该免疫传感器可较好的应用于人血清中的直接检测。敏感性高、特异性强、检测快速、成本低廉的特点使得该传感器在肿瘤标志物的诊断方面具有很好的应用价值及发展前景。另外该免疫传感器可以同时进行16个血清样本的检测。这种快速、灵敏、省时、高效的检测肿瘤标记物的方法为临床上肿瘤的诊断提供了一个新的平台。
【作者】李胜昔;
【导师】沈锡中;
【作者基本信息】复旦大学,内科学,2012,博士
【关键词】原发性肝癌;肿瘤标志物;甲胎蛋白;电化学免疫传感阵列;

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