人白介素25在毕赤酵母中的重组表达、纯化和活性研究

【摘要】白介素25(Interleukin-25,简作IL-25或IL25),曾命名为IL-17E,与IL-17的序列相似而被发现,是IL-17家族成员。同IL-17家族中其它五个成员相比,它的氨基酸序列同源性最低,只有16-20%,这提示它有不同于其它家族成员的功能。体外实验表明它可以诱导NF-κB激活,刺激IL-8和G-CSF的产生。小鼠体内研究表明它能作为一个促炎因子介导Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的表达,还会引起嗜曙红细胞增多、脾肿大、血浆IgG1、IgE和IgA增加等Ⅱ型免疫反应。IL-25在Ⅱ型免疫反应中的作用还表现为对寄生虫感染的免疫,这在小鼠免疫模型中得到证明。一些固有免疫细胞能够分泌Ⅱ型细胞因子,后者启动获得性免疫反应,在这个过程中,IL-25发挥了启动的作用。也就是说IL-25是具有介导固有免疫和获得性免疫两个途径的双功能分子。它是调节肺部炎症和哮喘疾病中呼吸道高反应性的潜在靶分子。对IL-25进行重组表达,以获得具有生理活性的重组蛋白,不仅仅有助于进一步对IL-25的功能、分子结构、作用途径等的研究,也将为开发成一种新型生物技术药物打下基础。对IL-25蛋白活性研究所需蛋白的重组表达主要是利用哺乳动物细胞进行瞬时转染表达。还没有形成稳定的细胞株系进行表达,表达量低。本论文选择了真核表达体系——可以利用甲醇作为诱导剂和营养成份暨单一碳源的毕赤酵母(Pichiapastoris)表达体系。我们先后运用了两个表达载体,可以多拷贝整合入酵母基因组的pPIC9K,和方便转化后抗性筛选的pPICZaA。构建了含有IL-25的cDNA成熟肽编码序列的4种表达载体,分别电转化了3种毕赤酵母宿主菌株,野生型X-33,组氨酸利用缺陷型GS115,以及醇氧化酶1(AOX1)缺陷型KM71。分别对转化子进行了多重筛选,首先是营养缺陷型和抗性筛选,接着是PCR鉴定目的基因是否整合到酵母染色体,最后也是最关键的是用摇瓶培养经过前几个步骤确定整合了目的基因的转化子,甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定在培养液上清中是否有目的蛋白表达。结果,在一系列转化菌株中,在使用pPICZaA构建的IL-25表达载体转化的X-33表达菌株的培养基中通过银染可以检测到rIL-25的表达产物。SDS-PAGE和Western-blot显示,重组蛋白有单体和二聚体两种形式的相应条带。通过裂解酵母菌体分析胞内蛋白的表达情况,发现使用pPICZαA-IL25转化的X-33菌体中目的蛋白IL-25的表达量也很低,这可能是人cDNA的密码子偏好性与毕赤酵母使用的密码子偏好性有差别造成了低水平表达。我们对人IL-25编码区cDNA编码子作了全序列的优化,使用了毕赤酵母的偏好密码子,同时兼顾序列的碱基组成、DNA及其转录后产物mRNA的稳定性和特殊结构的预防等,设计一系列引物进行了overlapPCR扩增,合成了经过密码子优化改造的cDNA序列。将上述cDNA序列与表达载体pPICZaA重组,转化表达菌株X-33,经过抗性筛选和诱导表达筛选。筛选到高表达菌株,实现了IL-25在毕赤酵母中的高效表达。利用高表达菌株,我们进行了高密度发酵。经过优化,我们确定培养液pH控制在5.0,培养温度为30℃,确定了诱导时甲醇的补加速率,氧气流量(溶氧)的控制的和其它一些参数。电泳检测显示从诱导后16小时开始在发酵上清中检测到了目的蛋白的表达,诱导44小时后,表达量不再增高时停止发酵,收集发酵上清。表达产物的初步纯化工艺,首先使用截留分子量为1000Da的超滤膜对上清进行浓缩,然后使用分子筛柱更换缓冲体系为50mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.8。经过过阴离子交换填料(QSepharoseFastFlow)吸附后,大部分杂蛋白都被Q柱吸附而目的蛋白在上样液中不被吸附。蛋白样品经过分子筛SephacrylS-100进一步纯化,去除了大分子量的杂蛋白,并更换平衡液为PB溶液,精纯的rIL-25分装冻干保存。每升发酵上清最后得到39.6毫克rhIL-25。文献表明IL-25在体外实验中能刺激一些上皮细胞和成纤维细胞上调G-CSF等细胞因子的表达。据此我们对纯化的IL-25进行了体外细胞学活性检测,Real-timePCR分析揭示,rhIL-25能够刺激人胚肺成纤维细胞HFL-I和293细胞的G-CSF的mRNA转录上调。使用ELISA检测方法在细胞上清中也检测到了G-CSF蛋白的表达量上调。这表明我们设计表达的rhIL-25具有与野生型相同的生物学活性。用pull-down实验证明,rhIL-25能够与它的受体IL-17RB特异性结合。在体外细胞实验中,我们还发现rhIL-25蛋白可以诱导乳腺癌细胞凋亡,我们对它的机制做了初步研究。我们发现乳腺癌细胞的IL-25受体表达量比非诱导凋亡的细胞高,凋亡是通过促进下游Caspase8并最终由caspase3信号通路实施的。对于其机制和信号通路的进一步研究,以及在其它肿瘤细胞中的作用的研究将拓展IL-25的应用,具有重要的意义。人IL-25在毕赤酵母中的高效表达,为其生物学活性和生理功能研究、分子结构的研究以及药物开发奠定了基础。
【作者】刘钰山；
【导师】于敏；
【作者基本信息】复旦大学，生物化学与分子生物学，2011，博士
【关键词】白介素-25毕赤酵母；密码子优化；高效表达；发酵；纯化与鉴定；活性测定；IL-17RB；细胞凋亡；

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