三种病理亚型肺癌组织中microRNA肿瘤标志物的发现、验证及其靶基因的初步筛选

【摘要】第一部分筛选三种病理亚型肺癌组织中microRNA的肿瘤标记物目的：筛选三种病理亚型肺癌组织中microRNA的肿瘤标记物。方法：应用激光捕获显微切割技术(LCM)从44例正常肺组织、36例腺癌、30例鳞癌及16例小细胞癌中获取纯的上皮细胞和肿瘤细胞。用AgilentmicroRNA芯片对上述标本进行全基因组microRNA表达分析。芯片数据经过Quantile标准化后用方差分析(ANOVA)进行显著性差异性分析,用聚类分析(Hierarchicalclustering)进行microRNA表达差异的分类,用芯片预测分析方法(PAMandWEAK)对芯片数据进行预测性分析。同时对7个候选microRNA肿瘤标记物在三种病理亚型肺癌诊断中进行受试者工作特征曲线(ROC)分析。结果：经过方差分析和聚类分析发现16个差异表达的microRNA可以区分三种肺癌病理亚型(肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌)。经过PAM预测分析发现17个microRNA可以区分肺癌亚型,准确率高达87%；经过WEAK预测分析发现13个microRNA可以区分肺癌亚型,准确率高达90%；两者交集发现7个候选microRNA:hsa-miR-25、hsa-miR-205、hsa-miR-34a、hsa-miR-375、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-27a。7个候选microRNA对肺癌亚型诊断的准确率(AUC值)达0.6230.992。结论：两个microRNA分类组及7个候选microRNA的肿瘤标记物可以准确鉴别诊断肺腺癌、鳞癌及小细胞癌,预示其参与了肺癌病理亚型的发病机制。第二部分验证候选microRNA中瘤标记物目的：在三种病理亚型肺癌组织中验证7个候选microRNA肿瘤标记物,建立诊断肺癌病理亚型的回归模型,并且分析7个候选microRNA的预后价值。方法：运用荧光实时定量PCR(Taqman)在207例石蜡组织标本中对7个候选microRNA中瘤标记物进行验证。在训练组中(30例正常肺组织、30例腺癌、27例鳞癌及32例小细胞肺癌),应用未配对t检验、ROC曲线及Logistic回归分析训练组数据,并建立诊断肺癌病理亚型的Logistic回归模型。在验证组中(22例正常肺组织、22例腺癌、23例鳞癌及21例小细胞肺癌),验证已建立的logistic回归模型并评估其模型在鉴别肺癌病理亚型中的诊断价值。运用Kaplan-Meier和LogRank对三种亚型肺癌患者进行生存分析和生存率比较,应用多变量COX回归分析7个候选microRNA在三种亚型肺癌患者的预后价值。结果：在训练组中,每个microRNA回归模型鉴别诊断正常肺组织和肺癌及三种亚型肺癌之间的准确率(AUC值)均在0.9以上。在验证组中,每个microRNA回归模型鉴别诊断正常肺组织和肺癌及三种亚型肺癌之间的准确率AUC值均在0.9左右。在两组中,hsa-miR-205在肺鳞癌中表达明显上调,hsa-miR-375在小细胞肺癌中表达明显上调。三种亚型肺癌患者的中位生存期(mediansurvivaltime:MST)(month)为：AC65,SQ53,SCLC18;三种亚型肺癌患者的生存率比较：ACvsSCLC、P-value=0.001;SQvsSCLC、P-value=0.002;ACvsSQ、P-value=0.715;每个候选microRNA在COX回归模型中的检验P值均大于0.05。结论：7个microRNA肿瘤标记物在石蜡组织标本中能准确鉴别正常肺组织和肺癌及三种亚型肺癌,进一步预示其在肺癌病理亚型发生发展中起重要作用,其中hsa-miR-205与肺鳞癌,hsa-miR-375与小细胞肺癌关系尤为密切。预示其参与了肺癌病理亚型的发病机制。AC患者和SQ患者的中位生存期无明显差异,但分别与SCLC患者相比,均明显高于后者。每个候选microRNA对三种亚型肺癌患者的预后判断无价值。第三部分预测和筛选microRNA肿瘤标记物的靶基因目的：预测7个microRNA肿瘤标记物的靶基因,并且进一步在组织水平上对hsa-miR-205和hsa-miR-375的预测靶基因进行筛选。方法：运用数据库miRecords对7个microRNA肿瘤标记物进行靶基因预测(整合了至少4个靶基因预测软件),再根据KEGG信号通路数据库(选择22个肺癌相关信号通路)对靶基因进行下一步筛选。在133例新鲜冰冻肺组织中(48例正常肺组织、37例腺癌、34例鳞癌及14例小细胞肺癌),应用荧光实时定量PCR(SYBER-Green)方法检测hsa-miR-205和hsa-miR-375的靶基因表达水平。使用t检验和差异倍数超过2倍的筛选条件以及microRNA-mRNA的正向或负向关系,筛选进一步待功能研究的靶基因。结果：通过miRecords和KEGG数据库,7个microRNA肿瘤标记物的靶基因的数目(包括多个信号通路中重复的基因)分别是：hsa-miR-205108个；hsa-miR-37537个；hsa-miR-25115个；hsa-miR-29a209个；hsa-miR-29b216个；hsa-miR-27a254个；hsa-miR-34a150个。在组织水平进一步筛选出的靶基因为：hsa-miR-205靶基因有12个：在肺腺癌中有2个(NCAM1和SMAD4;校正P值<0.05)；在肺鳞癌中有10个(ATP2B2、AXIN2、CACNA2D2、CDH3、E2F1、NCAM1、RELN、SMAD4、STAG1和RUNX1;校正P值<0.05)；在SCLC中有3个(NCAM1、KIT和CDC27；校正P值<0.05)。hsa-miR-375靶基因有5个：在肺腺癌中有1个(ITPKB;校正P值<0.05)；在肺鳞癌中有4个(CACNG2、ITPKB、PIAS1和RUNX1;校正P值<0.05)；在SCLC中有3个(ITPKB、NLK和PIAS1;校正P值<0.05)。结论：miRecords和KEGG数据库为microRNA靶基因预测提供了很好的途径。在组织水平上可以筛选待进一步功能研究的靶基因。同一个microRNA在不同亚型肺癌中的作用可能不一样。
【作者】黄威；
【导师】王春生；
【作者基本信息】复旦大学，心胸外科，2011，博士
【关键词】肺癌；肺腺癌；肺鳞癌；小细胞肺癌；miRNA；激光捕获显微切割；肿瘤标记物；靶基因预测；

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