硫化氢通过microRNAs调控血管新生的机制研究

【摘要】硫化氢(HydrogenSulfide,H2S)是一种无色、有臭鸡蛋气味的气体,大量吸入可致中毒。然而近年来,研究发现多种哺乳动物体内均能产生H2S。在大鼠和人的血浆中H2S含量约为25-65和25-80μmol/L。体内的H2S主要通过胱硫醚-p-合酶(CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)酶解L-半胱氨酸产生。CBS和CSE在哺乳动物组织细胞中广泛存在,前者主要存在于脑和神经系统,后者主要分布于心血管系统中。据文献报道,H2S在心血管系统、神经系统、消化系统、呼吸系统和内分泌系统等都具有重要的生理功能。由于能够内源性产生,并具有多种生理功能,H2S已成为继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三个气体信号分子。血管新生是指在原有血管基础上长出新的毛细血管。其过程包括血管外基质降解,血管内皮细胞增殖、迁移形成子代血管支和子代血管支获得血运功能。血管新生可发生于组织生长发育、创伤修复和肿瘤生长等多种生理、病理过程中。MicroRNAs是一类内源性的、保守的、由大约22nt(nucleotide)组成的非编码RNA,它们通过与靶基因mRNA的3’-非翻译区(3’-untranslatedregions,3’-UTR)完全或不完全互补配对,降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译。据估计在哺乳动物体内,约30%的基因表达受到microRNAs的调控。microRNAs几乎参与了各种生物学过程,其中也包括血管新生。我们课题组的前期研究发现,H2S促进恒河猴脉络膜-视网膜内皮细胞株RF/6A体外血管新生；H2S能促进C57小鼠Matrigelplug模型及鸡胚绒毛膜尿囊模型中的血管新生；在大鼠单侧后肢缺血模型中,H2S显著促进血管新生,并有效改善缺血区的血供。可以看出,H2S对血管新生有一定的调控作用,但具体机制仍有待进一步深入地探寻。目前有关microRNAs与H2S生物学功能的联系尚未见报道。本课题以microRNAs为切入点,观察H2S是否能引起体外培养的内皮细胞microRNAs变化,该变化又是否参与了H2S调控血管新生的过程。首先,我们观察了H2S对人脐静脉内皮细胞(HumanUmbilicalVeinEndothelialCells,HUVECs)体外血管新生的作用。考虑到先前关于H2S促进体外血管新生的效应是在内皮细胞株RF/6A中观察到的,后者与原代内皮细胞有一定差异,因此本课题的实验对象为原代培养的HUVECs。使用NaHS水溶液作为H2S的供体。分别使用BrdU掺入法、划痕损伤模型和管腔形成实验观察H2S对HUVECs增殖、迁移和形成管腔能力的影响。结果显示,NaHS(10μmol/L)促进细胞增殖,NaHS(30-200μmol/L)促进细胞迁移并能提高HUVECs在体外形成管腔的能力。通过以上实验,进一步证实了H2S促进内皮细胞血管新生的作用。接下来,我们利用microRNAs芯片技术,观察H2S引起人脐静脉内皮细胞microRNAs的变化。NaHS(50μmol/L)给药12h组有12个microRNAs表达水平发生变化,其中6个microRNAs(miR-923、miR-154*、miR-483-5p、miR-195*、miR-640和miR-451)表达降低,6个microRNAs(miR-421、miR-604、miR-192、miR-29b-1*、miR-455-3p和miR-136*)表达升高。我们结合文献报道以及microRNAs靶基因分析,使用实时定量PCR对其中的3个microRNAs(miR-640、miR-455-3p和miR-192)芯片结果进行了验证,结果一致。然后,我们进一步对上述3个microRNAs(miR-640.miR-455-3p及miR-192)进行功能分析。通过转染特异的microRNA前体(Pre-MiRNAPrecursormolecule)和抑制剂(Anti-MiRNAInhibitormolecule),分别过表达和阻断相应的microRNA表达,利用划痕损伤模型和管腔形成实验对这3个microRNAs进行功能分析。结果显示,芯片中表达下调的miR-640抑制体外血管新生,而表达上调的miR-455-3p和miR-192均能促进体外血管新生。最后,我们对这3个microRNAs进行靶基因预测和鉴定。利用生物信息学方法从目前常用的数据库中对这3个microRNAs进行靶基因预测,并运用westernblotting实验进行初步验证。结果如下：1、miR-640miR-640的基因序列与缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的编码基因HIF1A3’UTR有3个结合位点。过表达miR-640后,HIF-1α蛋白表达减少；抑制miR-640后,HIF-la蛋白表达增多。使用NaHS(50μmol/L)处理HUVECs后,HIF-1α的蛋白表达量升高,受其调控的VEGF蛋白表达也升高。以上结果提示HIF1A可能为miR-640的靶基因,miR-640可能是通过调节HIF-1α参与了H2S促进血管新生的过程。有待运用荧光素酶报告实验进一步验证。2.miR-192文献报道TGF-p诱导miR-192升高,后者降低PTEN表达从而使Akt磷酸化。我们前期实验观察到H2S引起HUVECs中TGF-β表达水平升高,提示miR-192水平的升高可能是H2S的直接效应或间接由TGF-β介导。过表达miR-192后,PTEN表达减少,Akt磷酸化水平升高；反之亦然。提示miR-192可能通过抑制PTEN,促进Akt磷酸化从而促进血管新生。但是NaHS(50μmol/L)处理HUVECs后,PTEN和Akt磷酸化水平并未改变,提示NaHS(50βmol/L)的促内皮细胞迁移和管腔形成的作用可能不是通过miR-192/PTEN/Akt途径实现的,miR-192参与H2S促血管新生作用的方式仍需进一步实验探寻。3、miR-455-3p生物信息学分析提示miR-455-3p的基因序列与FIH(factorinhibitingHIF1)的编码基因HIF1AN3’UTR有2个结合位点。有待进一步的实验鉴定FIH为miR-455-3p的靶蛋白。综上所述,本课题的研究发现,H2S能促进HUVECs体外血管新生,并引起microRNAs表达水平发生变化。miR-640具有抑制HUVECs体外血管新生的作用,miR-192和miR-455-3p具有促进HUVECs体外血管新生的作用。H2S可能通过下调miR-640,引起miR-640的靶分子HIF-la表达升高,发挥促进血管新生的作用。通过本课题研究,深入了对H2S促血管新生作用机制的理解,为microRNAs参与气体分子的生物学作用提供了新思路；同时观察到3个microRNAs对血管新生的调控作用,期待为临床治疗疾病提供新靶点。
【作者】张彩彩；
【导师】朱依纯；
【作者基本信息】复旦大学，生理学，2011，博士
【关键词】硫化氢；血管新生；人脐静脉内皮细胞；microRNAs；生物信息学；靶基因缺氧诱导因子-1α；

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