裂殖酵母DNA损伤应答基因的全基因组筛选研究

【摘要】基因组无时无刻不受到外界化学试剂以及内部生命过程中所带来的DNA损伤的威胁,而这些损伤正是癌症发生、衰老、免疫缺陷以及一些退行性疾病的根源。细胞为了维持基因组的稳定性,在进化中形成了一套应对DNA损伤的机制,包括细胞周期阻滞、DNA损伤修复、凋亡等。其中许多基因参与到这些通路中并发挥着重要的作用,虽然目前已经发现许多参与DNA损伤应答的基因,然而仍然有绝大多数参与DNA损伤应答的新基因有待发现和进一步分析研究。为了进一步完善DNA损伤应答网络,我们以裂殖酵母作为研究对象,利用紫外照射以及5种DNA损伤试剂对3235个裂殖酵母基因缺失突变体进行系统的筛选。最终筛选得到55个参与DNA损伤应答的基因,其中23个未曾有过相关的文献报道。对55个基因进行GO分析发现有19个(占34.5%)基因参与了细胞周期相关的生命过程。流式细胞术分析55个突变体细胞的DNA含量发现其中38个突变体的细胞周期在正常或者DNA损伤条件下发生了阻滞,呈现了四种不同的流式表型,说明这些基因直接或间接的参与了细胞周期的调控过程。为了进一步分析筛选获得的新基因在DNA损伤应答中的功能,我们从四类流式表型中各选出两个突变株(△ash2,△SPAC3F10.17,△SPBC2A9.02,△SPAC27D7.08c△sgf73,△meu29,△sec65,△pab1)进行表达谱芯片分析,这些突变株均对两种以上DNA损伤试剂敏感。结果显示8个突变体芯片数据的聚类分析结果与表型分类相一致,而且8个基因中任意一个的缺失均能引起DNA复制以及细胞分裂相关基因的差异表达。基因回补、形态学鉴定及realtimePCR实验结合表达谱芯片结果发现：其中SPBC2A9.02和SPAC27D7.08c通过影响DNA复制起始相关蛋白Abpl以及Abp2的功能来调控DNA复制起始；SGF73、MEU29、SEC65或者PAB1的缺失会通过影响Sep1-Ace2转录途径来影响细胞分裂后期两个子细胞的正常分离,从而引起突变体细胞二倍体化；同时,SGF73或MEU29的缺失也会降低APB1和APB2的表达,从而影响了DNA复制的起始；另外,SEC65和PAB1也与DNA的重复复制有关,他们的缺失引起了与DNA重复复制有关的CDC18、CDT1以及CDT2等基因的表达上调。这些结果说明这些基因通过参与DNA复制以及细胞周期的调控来参与DNA损伤应答,本研究还发现了许多基因通过参与染色质动态平衡、基因转录调控、DNA损伤修复等机制来参与DNA损伤应答。总之,这些新基因的发现以及鉴定对于进一步揭示和完善DNA损伤应答机制具有重要的意义。碱性甘露聚糖酶是一种半纤维素酶,它能在碱性环境下将甘露聚糖水解成具有重要商业价值的甘露寡糖,因而在食品、医药、饲料、造纸等行业具有重要的应用价值。为了获得高活性、高稳定性的碱性甘露聚糖酶,本研究中我们对枯草芽孢杆菌Bacillussp.N16-5来源的碱性甘露聚糖酶(MAN493)进行了一定的改造,去除了其C端163个氨基酸,保留其催化结构域,获得了一个截短的碱性甘露聚糖酶(MAN330),并实现了其在鹰嘴豆孢克鲁维酵母(Kluyveromycescicerisporus)中的高效分泌表达。该重组工程菌株在80世代后仍能稳定地表达碱性甘露聚糖酶。截短的碱性甘露聚糖酶MAN330及其全长蛋白MAN493的酶学属性分析结果表明,MAN330具有与MAN493相同的最适反应pH值、最适反应温度以及底物特异性。然而,在pH值9-11范围内MAN330的pH值稳定性比MAN493的pH值稳定性高7%左右,在60℃C-80℃C范围内MAN330的热稳定性比MAN493的热稳定性高10%左右,可见MAN330比其全长蛋白MAN493具有更广泛的应用价值。因而我们用鹰嘴豆孢克鲁维酵母重组工程菌在摇瓶以及15L发酵罐水平建立了生产碱性甘露聚糖酶MAN330的最适条件,达到的最高产量分别为1378U/ml和3795U/ml。该研究对工业化生产以及应用碱性甘露聚糖酶奠定了一定的基础。
【作者】潘贤；
【导师】吕红；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2011，博士
【关键词】DNA损伤应答；裂殖酵母；基因缺失突变体库；细胞周期；DNA复制；碱性甘露聚糖酶；鹰嘴豆孢克鲁维酵母；重组工程菌株；酶学属性；

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