双功能融合蛋白RDP-BDNF的制备及其对东莨菪碱所致认知功能障碍小鼠的作用

【摘要】脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)是脑内广泛存在的一种蛋白质,由脑组织合成,主要存在于中枢神经系统,尤以上丘脑、海马、大脑皮层和纹状体部位含量最高。BDNF在中枢神经系统发育中起重要作用,能够维持多种神经元的存活、分化及生长发育,并促进受损神经元的恢复与再生对突触间经典递质的释放有增强作用,影响神经元的可塑性。研究发现,BDNF含量和分布的变化与很多神经退行性疾病的发病机制有很大关系,且向脑内补充外源性BDNF对神经退行性疾病有治疗作用。血脑屏障(Blood-brainbarrier,BBB)主要由脑毛细血管内皮细胞(BrainMicrovascularEndothilialCells,BMECs)及其之间的紧密连接组成,若外源性物质要通过BBB必须满足两个条件：1)分子量必须小于500Da；2)脂溶性高。由于BDNF属于大分子阳离子蛋白质,外源性BDNF很难通过血脑屏障而发挥作用,因此,如何将外源性BDNF蛋白转运入脑仍是一项挑战。迄今为止,克服BBB的中枢系统给药方法包括两类：其一是侵入性给药方法；包括脑内定位注射、脑室内或海马穿刺给药、脑部移植工程化细胞等,然而该类方法因其缺点：药物很快被组织清除、不易扩散、浓度梯度大、技术要求高、风险大等而不能应用于临床。其二是非侵入性给药方法；该类方法通过载体的介导将生物大分子转运入脑,其具有高效、低毒、安全、方便等优点。将蛋白质或多肽载体与外源性大分子物质通过基因工程的方法连接,在工程菌中表达融合蛋白,可以实现载体协助大分子物质进行入脑转运。狂犬病毒糖蛋白(rabiesvirusglycoprotein,RVG)具有嗜神经性,能够携带其他物质向中枢神经系统转运。序列分析显示,RVG上的189-214和330-357氨基酸序列是病毒与神经元连接的关键部位,我们将330-357这段序列与含九个精氨酸的膜转导肽(cellpenetratingpeptides,CPPs)通过3个甘氨酸连接后形成RVG衍生肽(RVG-derivedpeptide,RDP(KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGGGRRRRRRRRR)).RDP能够携带多种大分子蛋白质穿过血脑屏障并发挥生物学作用。本文试图通过基因工程的方法将RDP基因与BDNF基因融合并在大肠杆菌中诱导表达,将融合蛋白经尾静脉注射入小鼠体内,通过ELISA法检测RDP介导的BDNF蛋白在小鼠体内的分布,采用Morris水迷宫的方法探究RDP-BDNF对东莨菪碱所致认知障碍模型小鼠的作用,并研究其作用机理。实验结果表明,重组的RDP-BDNF能够跨血脑屏障并发挥其神经营养活性,能改善东莨菪碱诱导的认知功能障碍小鼠的学习记忆能力,其作用机制可能与提高认知障碍模型小鼠脑内BDNF水平,从而增强胆碱能神经系统的功能及维持氧化应激状态平衡有关。
【作者】张苗苗；
【导师】付爱玲；
【作者基本信息】西南大学，微生物与生化药学，2014，硕士
【关键词】RDP-BDNF；血脑屏障；水迷宫；认知障碍；

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