鼠妇蛋白提取物的镇痛作用研究

【摘要】疼痛(Pain)是伴随现有的或者潜在的组织损伤而产生的主观感受,是机体对有害刺激的一种保护性防御反应。疼痛作为很多疾病的伴随症状,也经常会导致患者极大的不安。但是目前应用的镇痛药由于存在成瘾性及明显的不良反应而使其应用受到很大的限制,因此寻找一种高效低毒的镇痛药物对临床产生深远的影响。鼠妇为鼠妇科动物平甲虫的干燥全体,富含蛋白、还原糖与糖原、各种脂类、硫酸软骨素A或C、透明质酸、胆甾醇、蚁酸等。鼠妇具有破血、利水、解毒、止痛之功效。临床上,鼠妇对中重度癌痛及术后疼痛有良好的镇痛作用,尤其是用于肝癌晚期的止痛,镇痛效果持久性优于杜冷丁。大多数资料中,对鼠妇镇痛研究都为醇提物和水提物,镇痛作用的化学成分不清楚。本论文拟求寻找出鼠妇镇痛的成分,因此对鼠妇中蛋白质的制备和镇痛作用进行研究。本论文的主要研究内容和结果如下：(1)鼠妇蛋白制备及成分研究采用了三种方法制备了三种富含蛋白成分的鼠妇提取物,分别为酶法制备的提取物(EE),酸碱法制备的提取物(AAE)和水提醇沉法制备的提取物(WEE)；对三种提取物中氨基酸组成特别是兴奋氨基酸和抑制氨基酸含量以及各提取物中甾醇的含量进行了测定。首先是酶提法,通过单因素试验确定物料比、提取时间、提取pH值三个因素的最佳条件,然后通过正交试验得到酶提法制备工艺的最佳条件是物料比1：8,提取时间4h,提取pH值2；其次是酸碱法,通过单因素试验确定HC1调pH值、提取时间、NaOH调pH值三个因素的最佳条件,通过正交试验找出酸碱法最优提取条件为HC1调pH值4,提取时间12h,NaOH调pH值9；最后是水提醇沉法,通过单因素试验确定物料比、提取时间、醇含量三个因素的最佳条件,通过正交试验得到水提醇沉法提取最佳工艺是物料比1：10,提取时间2h,醇含量为85%。三种方法提取鼠妇蛋白的粗蛋白得率分别为酶法50.242%,酸碱法58.698%,水提醇沉法34.224%。鼠妇蛋白成分研究中,氨基酸分析表明,各种方法提取物中含有常见的组成蛋白的18种氨基酸；尤其是与疼痛有关的兴奋氨基酸(天门冬氨酸和谷氨酸)和抑制氨基酸(甘氨酸和Y-氨基丁酸)含量较高。不同制备方法得到的鼠妇提取物中兴奋氨基酸含量和抑制氨基酸含量有显著差异。兴奋性氨基酸含量最低的是酸碱法4.347%,其次为酶提法8.848%,水提醇沉法为11.43%；抑制性氨基酸含量大小顺序依次为酸碱法4.951%,酶法3.160%,水提醇沉法2.832%。鼠妇蛋白提取物中总甾醇含量总体比较低,不同提取方法差异显著,酶法总甾醇为84.93mg/g,酸碱法总甾醇为51.83mg/g,水提醇沉法总甾醇为38.88mg/g。综上所述,不同提取方法中以粗蛋白得率、与疼痛有关的氨基酸含量、总甾醇含量等为指标进行综合评价,得出鼠妇蛋白提取的酸碱法优于酶法和水提醇沉法。由于水提醇沉法的各项指标均为最低,因此在后续试验研究中排除了水提醇沉法。(2)鼠妇蛋白提取物镇痛作用研究利用醋酸扭体实验和热板反应实验观察提取物(AAE和EE)对小鼠镇痛作用。结果表明：在醋酸扭体实验中,AAE和EE均能减少醋酸所致小鼠扭体次数,且随剂量增加抑制增强。在360mg/kg时,AAE对促使是是是所致小鼠扭体次数抑制率高达76.86%,EE为16.59%,表明AAE的种抑制作用比EE强。热板反应实验中,AAE和EE均随剂量增加而增加痛阈值,在45分钟时,痛阈值达最高。AAE在360mg/kg时,最高痛阈值可以达到40.37s,而EE痛阈值仅为25.75s。上述结果表明,AAE镇痛效果明显优于EE,其对醋酸所致小鼠扭体的抑制率和热板实验中痛阂值的提高均较强。(3)鼠妇蛋白提取物镇痛作用机理的初步研究鼠妇蛋白提取物的镇痛机制不明确,是否与环氧化酶途径的抗炎镇痛类有关尚不清楚,因此采用二甲苯致小鼠耳肿胀实验测定鼠妇蛋白提取物的抗炎作用。同时采用高效色谱(HPLC)-荧光分析方法研究了小鼠脑中的单胺递质,包括去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的变化。结果显示,EE在360mg/kg高剂量时,对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制率仅为5.40%,AAE为5.81%,说明AAE和EE对二甲苯致小鼠耳肿胀没有抗炎作用,说明机制不是通过抑制环氧化酶达到镇痛作用。给药小鼠脑脑组织中的NE,DA及5-HT和空白比均显著提高,AAE在360mg/kg时,NE含量高达552.590ng/g,DA含量为1622.832ng/g,5-HT的含量都高达249.121ng/g,且比EE组高。可以初步推测鼠妇镇痛作用可能与影响单胺递质类水平有关。(4)鼠妇蛋白提取物的细胞毒性和小鼠急性毒性研究细胞毒性实验主要采用MTT比色法分别测试提取物(AAE和EE)对肝癌细胞及子宫颈癌细胞的毒性作用。结果显示,两种(AAE和EE)提取物对肝癌细胞的抑制率均小于16.20%,对子宫颈癌细胞抑制率均小于24%,不呈现明显的抑制作用,说明提取物对细胞的毒性小。小鼠急性毒性实验考察了14天,1.08g/kg的高剂量蛋白提取物对小鼠毒性研究,结果表明小鼠前2天食量有所下降,3天后食量基本恢复正常,给药14天内,未见小鼠死亡。
【作者】杨雅莉；
【导师】袁吕江；
【作者基本信息】西南大学，药物分析，2014，硕士
【关键词】鼠妇；蛋白提取物；镇痛；单胺递质；

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