大鼠上皮性卵巢癌诱发模型的血清蛋白质组学研究

【摘要】卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,病理类型复杂多样,90%来自于卵巢表面生发上皮(Ovariansurfaceepithelium,OSE),称为上皮性卵巢癌(Epithelialovariancarcinoma,EOC),位居妇科恶性肿瘤首位,在美国每年有21650例新发病例,死亡率达到了71.7%。原因在于EOC起病隐匿,缺乏有效的早期诊断措施,70%以上的患者在就诊时已处于临床晚期阶段,尽管近几年来的外科手术和药物治疗等方面已较前取得了很大进展,5年生存率仍然徘徊在25%～30%,然而如能早期就诊,应用现有的治疗手段,生存率可大大提高至94%。因此寻找一种方便且无创或微创取材的血清肿瘤标志物作为早期诊断和治疗靶向的重要辅助手段变得异常重要。肿瘤的发生发展总是伴随着蛋白质水平的不断变化。血清样品易于获取并可随时监测,应用血清蛋白质组学技术,可以直接从生物功能的执行者—蛋白质入手,动态、整体、定量地考察EOC在蛋白质水平的变化与其发生发展不同阶段的相互关系及其规律,有助于找到EOC特征性血清蛋白质表达谱(proteinexpessionprofile,PEP),从而找到EOC特异性血清标志物,对EOC的早期诊断、分型及预后等提供极有价值的信息。利用蛋白质组学这项技术筛选用于肿瘤早期诊断的血清蛋白质组模式(proteomepattern)是生物医学界的一个研究热点。同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ)技术,是近年来在质谱技术基础上发展起来的定量蛋白质组学研究方法,能够精确地分析多种样本中蛋白质表达量的差异,从而使蛋白质组学真正成为一种差异显示技术。EOC包括四种主要的组织学亚型,分别为卵巢浆液性腺癌(Ovarianserouscancer,OSC)、卵巢粘液性腺癌(Ovarianmucinouscancer,OMC)、卵巢子宫内膜样腺癌(Ovarianendometrioidadenocarcinoma,OEA)和卵巢透明细胞腺癌(Ovarianclearcelladenocarcinoma,OCCA)。不同亚型EOC发生发展分别与各自不同分子事件相关,具有不同的分子表达谱,且不同亚型的临床表现和生物学行为各异,对化疗的反应亦不相同。因而,同一分子标志物在不同组织亚型中具有不同的诊断和预后价值,另外单一的分子标志物在肿瘤的发生早期到晚期的进展过程中,其表达呈规律性变化,但仅限于单一的组织亚型。然而,目前为止,大多数识别的EOC标志物并非是亚型特异性,针对EOC的治疗手段也非亚型特异性。因此,为改善EOC预后,提高患者生存率,只有将不同亚型EOC分开研究,才可能确切识别和评估不同亚型EOC各自的特异性分子标志物作为早期诊断的有效手段,从而使不同亚型EOC治疗的个体化成为现实。构建合适的动物模型可以模拟人EOC患者体内蛋白质表达谱的动态变化,为此,本课题的第一部分,通过浸渍二甲基苯蒽(7,12-dimethylbenz[a]anthracene,DMBA)的丝布片原位布片包埋法构建Wistar大鼠EOC诱发模型,并通过病理切片HE染色判断动物模型的成功诱发率。该方法能最大限度获得EOC模型,病理上酷似人卵巢癌常见的类型,肿瘤组织病理显示细胞特征符合卵巢致癌过程中所有改变,在术后32周卵巢肿瘤的诱发率达64%,高于国内外文献报道的结果。诱发肿瘤的均一性较好,基本为EOC,诱发率高达60%,尤其以卵巢浆液性腺癌多见,然而临床上预后最差的卵巢粘液性腺癌和卵巢透明细胞腺癌诱发率相对较低,此外,诱发的卵巢肉瘤比国内外文献报道的少,仅4%。通过对EOC造模术前和术后不同发生发展阶段及不同亚型EOC荷瘤鼠血清标本的采集,使动态观察不同亚型EOC体内发生发展过程成为可能,并为进一步深入研究EOC的早期诊断标志物和分型并最终为EOC的靶向治疗提供了坚实的理论基础。为评价这种诱发模型动态模拟人EOC发生发展过程中蛋白质表达谱变化的可行性,在第二部分,我们将收集诱发得到的卵巢浆液性腺癌模型鼠诱癌术前及诱癌术后不同发生发展阶段的血清,配合同时期的空白组和正常对照组模型大鼠的血清,分别混合成池,经Proteominer富集低丰度蛋白后,联合应用iTRAQ标记定量技术和二维液相色谱串联质谱联用技术(two-dimensionalliquidchromatography-tandemmassspectrometry,2DLC-MS/MS)比较分析大鼠卵巢浆液性腺癌发生发展过程中特异性的血清蛋白质表达谱的动态变化,旨在寻找卵巢浆液性腺癌相关的早期变化的特异性血清标志物。与卵巢浆液性腺癌模型组内比较,在大鼠浆液性腺癌诱发过程中共鉴定到22种显著差异表达蛋白,其中14种表达显著上调蛋白和8种表达显著下调蛋白；而与空白组和正常对照组模型鼠相比,在卵巢浆液性腺癌荷瘤鼠血清中共鉴定到27种显著差异表达蛋白,其中13种表达显著上调蛋白和14种表达显著下调蛋白。Westernblot方法验证表明：相比较于空白组模型大鼠血清,蛋白Clu在大鼠浆液性腺癌诱发过程中表达显著上调,而蛋白Gsn在浆液性腺癌诱发过程中表达显著下调,其表达变化趋势与质谱结果吻合,与以往文献报道一致,在一定程度上证实了蛋白质组学技术筛选卵巢浆液性腺癌发生发展相关蛋白质的可行性。另外,Apoal,Apob,Hpx和Itih1等差异表达蛋白质可能与浆液性腺癌发生发展相关,也可能是浆液性腺癌潜在的特异性早期诊断标志物,还可能是潜在的具有应用前景的靶向治疗靶点。在第三部分,我们收集同时期不同亚型EOC荷瘤鼠血清,配合同时期的空白组和正常对照组模型大鼠的血清,分别混合成池,经安捷伦的高丰度蛋白去除(multipleaffinityremovalsystem,MARS)柱去除血清中三种主要的高丰度蛋白(白蛋白、转铁蛋白及免疫球蛋白IgG)后,联合应用iTRAQ标记和2DLC-MS/MS蛋白质组学技术路线比较分析不同EOC亚型特异性的血清蛋白质表达谱,旨在寻找EOC亚型特异性早期变化的血清标志物。与空白组和正常对照组相比,在四种不同亚型EOC组血清中共鉴定到14种显著差异表达蛋白,其中8种显著持续高表达蛋白和6种显著持续低表达蛋白。去除这几种持续表达的差异蛋白,相比较于空白组和正常对照组,在卵巢浆液性腺癌荷瘤鼠血清中共鉴定到21种差异表达蛋白,其中11种表达显著上调蛋白和10种表达显著下调蛋白；在卵巢粘液性腺癌荷瘤鼠血清中共鉴定到20种差异表达蛋白,其中13种差异蛋白显著高表达和7种差异蛋白显著低表达；在卵巢子宫内膜样腺癌荷瘤鼠血清中共鉴定到18种差异表达蛋白,其中5种差异蛋白显著高表达,13种差异蛋白显著低表达；在卵巢透明细胞腺癌荷瘤鼠血清中共鉴定到7种差异表达蛋白,其中2种差异蛋白显著高表达,5种差异蛋白显著低表达。综上可见,蛋白F2和Saa4为粘液性腺癌特异性差异表达蛋白,在EOC其它亚型中表达未见明显差异。Westernblot方法验证表明：相比较于空白组,蛋白Ponl在四种不同亚型EOC模型组血清中表达均显著下调；蛋白Clu在粘液性腺癌荷瘤鼠、子宫内膜样腺癌荷瘤鼠和透明细胞腺癌荷瘤鼠血清中表达均显著上调,而在浆液性腺癌荷瘤鼠血清中表达无明显差异；此外,蛋白Plg在浆液性腺癌荷瘤鼠、粘液性腺癌荷瘤鼠和子宫内膜样腺癌荷瘤鼠血清中表达显著下调,而在透明细胞腺癌荷瘤鼠血清中表达无明显差异,这些结果均与质谱结果一致,在一定程度上证实了蛋白质组学技术筛选不同亚型EOC相关蛋白质的可行性。为将来转入临床,作为辅助手段用于不同亚型EOC患者的早期诊断、分型及预后等提供极有价值的信息,从而使靶向治疗的个体化成为现实,最终提高EOC患者的临床疗效和生存率打下良好的前期实验基础。综上所述,本课题采用新型方法——原位布片包埋法构建的Wistar大鼠EOC诱发模型,能够完整并动态地演示卵巢浆液性腺癌发生发展过程中及不同亚型EOC的血清蛋白表达谱,找到卵巢浆液性腺癌相关的极早期特异性诊断标志物及不同亚型EOC的特异性标志物。本课题为改善卵巢浆液性腺癌早期诊疗现状和EOC分型奠定了坚实的理论和实验基础。
【作者】黄以萍；
【导师】徐丛剑；
【作者基本信息】复旦大学，妇产科学，2011，博士
【关键词】上皮性卵巢癌；卵巢浆液性腺癌；卵巢粘液性腺癌；卵巢子宫内膜样腺；癌；卵巢透明细胞腺癌；血清；蛋白质组学；DMBA；2DLC-MS/MS；MARS；

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