缺锌胁迫下柑橘的生理变化及ZIP家族基因克隆与表达分析

【摘要】锌是柑橘生长发育必不可少的微量矿质营养元素,参与核酸、蛋白质合成、脂质代谢、激素代谢、光合作用、生物膜完整性的维持、活性氧的清除等多种生理生化过程。然而,缺锌在柑橘生产中普遍存在,极大影响柑橘产量和品质。现有的营养诊断与矫治手段也难以解决柑橘缺锌问题。为此,本研究拟从基础研究入手,研究柑橘在缺锌胁迫下的生理生化及基因表达变化规律,克隆柑橘缺锌响应相关基因,并进行功能预测分析,为发展新的柑橘缺锌早期诊断与矫治方法奠定理论基础。本研究以田间8年生卡里佐枳橙(Carrizocitrange,Citrussinensis(L.)Osbeck×Poncirustrifoliata(L.)Raf.)砧凤晚脐橙为试验材料,测定不同程度斑驳黄化缺锌叶片的矿质营养元素含量、叶绿素含量、光合作用能力、抗氧化酶活性及ZIP(ZRT,IRT-likeprotein)家族基因的表达水平；以水培缺锌处理枳(Poncirustrifoliata(L.)Raf.)幼苗为试验材料,测定缺锌胁迫处理不同时间下根、叶中ZIP基因的表达水平并克隆相关基因序列。主要结果如下：1、缺锌对柑橘叶绿素含量和光合作用的影响。首先对田间对照、轻度、中度和重度斑驳黄化叶片的11种营养元素含量测定分析表明,随黄化程度加重,锌含量显著下降,其他元素无显著差异,证明缺锌是导致叶片黄化的主要原因。以此叶片样品测定叶绿素含量和光合作用表明：随缺锌程度(黄化程度)的加重,叶绿素含量和类胡萝卜素含量逐渐下降,其中中度、重度缺锌叶片较对照叶片呈极显著下降,但轻度缺锌叶片与对照叶片无显著性差异；叶片净光合速率随缺锌程度加重呈现显著的下降趋势,气孔导度和蒸腾速率也均有不同程度的下降,胞间CO2浓度在重度缺锌时比对照、轻度和中度缺锌时均有较大提高。2、缺锌对柑橘抗氧化能力的影响。与对照叶片相比,轻度缺锌叶片可溶性蛋白质含量显著升高,中度和重度缺锌叶片则显著下降；对酶活性的影响则表现为重度缺锌叶片的POD、SOD和CAT酶活性显著增强,Cu-ZnSOD酶活性显著下降,其它无显著性差异。3、ZIP家族基因在田间不同缺锌程度柑橘叶片中表达差异。与对照叶片相比,ZIP1基因在轻度缺锌时表达量下调1.8倍,而在中度、重度缺锌叶片中显著升高；ZIP3和ZIP4基因表达量随缺锌程度的加剧呈显著升高趋势,ZIP2基因表达量则在各分析样品中无显著变化。上述结果说明,ZIP家族不同基因在不同程度的缺锌胁迫下表达量有所不同,其中ZIP、ZIPS和ZIP4基因明显受缺锌诱导。4、ZIP家族基因在枳水培幼苗不同缺锌时间下表达变化。枳幼苗在缺锌处理不同时间后,分析了ZIP家族基因在根系和叶片中的表达水平。在根系中,ZIP1基因在缺锌第3天表达量显著上调,15天达到最高,是0天时的11倍；在叶片中,ZIP1基因在缺锌第1天就上调表达2倍以上,其中15天时上调约24倍。ZIP2基因在根系中无显著表达变化,各时间点趋于平稳,在叶片中,仅在缺锌9天和15天上调表达约2.5倍。ZIP3和ZIP4基因在根系中,以及ZIP3基因在叶片中,随缺锌时间的延长,表达量呈逐渐上升趋势,其中ZIP3基因均是在缺锌第15天时达到最高,第21天在叶片中稍有下降,ZIP4基因在根系中缺锌第9天达到最高,15天时稍有下降。ZIP4基因在叶片中,在缺锌1天、3天、5天、9天时表达上调约2-3倍,但在15天时表达量显著升高至18.3倍。上述结果表明,ZIP1、ZIP3和ZIP4基因受缺锌诱导明显。5、ZIP家族基因克隆。本试验从枳中同源克隆出3个ZIP基因完整CDS(Codingsequence)序列,分别命名为PtrZIP、PtrZIP2和PtrZIP4,片段大小分别为1224bp、1373bp和1488bp。PtrZIP1基因包括一个长度为1056bp的ORF(OpenReadingFrame),编码351个氨基酸,其蛋白分子量大小约为37.5kD,理论等电点约为5.6；PtrZIP2基因包括一个长度为639bp的ORF,编码212个氨基酸,蛋白分子量大小约为23.3kD,理论等电点约为4.6;PtrZIP4基因包括一个长为1260bp的ORF,编码419个氨基酸,蛋白分子量大小约45.0kD,理论等电点约为6.4。生物信息学分析表明,3个基因的编码蛋白均具有明显的zip保守结构域,同属于ZIP转运蛋白家族,且包含5-8个跨膜结构域,在细胞中可能主要以转运蛋白的形式发挥重要功能。
【作者】邢飞；
【导师】彭良志；付行政；
【作者基本信息】西南大学，果树学，2014，硕士
【关键词】柑橘；缺锌；生理变化；ZIP家族基因；基因克隆；基因表达；

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