蜡梅（Chimonanthus praecox）CpCPC基因的克隆及功能初步分析

【摘要】转录因了是能与真核基因启动子区的顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白。MYB转录因子家族是植物中最大的转录因子家族,这个家族的基因有共同的DNA结合区域——MYB结构域。根据包含MYB结构域的数量,MYB转录因子家族可分为三个亚家族,分别是SingleR-MYB,R2R3-MYB,以及R1R2R3-MYB.MYB蛋白主要具有控制植物细胞的形态和模式建成,调控植物类黄酮代谢和参与对植物激素的应答等功能。CPC基因属于SingleR-MYB亚类。现有研究主要集中在CPC基因对根毛以及表皮毛的形态建成的影响。其中CPC基因在表皮毛发育过程中起到负调控作用,而在根毛形成过程中起到正调控作用。也有研究表明,AtCPC基因也参与了黄酮类物质的合成过程。本研究在实验室已经构建好的蜡梅花cDNA文库的基础上,进行EST分析,并通过文库随机克隆测序,得到了CPC基因的EST序列,进一步利用RACE技术,克隆得到蜡梅CPC基因的全长cDNA,将其命名为CpCPC.在使用生物信息学手段对该基因进行序列特征和进化分析的基础上,构建了植物超表达载体使其在烟草中表达,通过观察转基因烟草的根毛发育情况以及黄酮类物质含量的测定,来研究CPC基因对根毛发育以及黄酮类物质合成的影响；通过实时荧光定量PCR进行基因表达分析,对该基因进行转录水平的表达分析。获得的主要结果如下：1.CpCPC的克隆及分子特征分析：通过随机挑选蜡梅花cDNA文库测序,获得了大小约为600bp的EST序列,然后通过RACE技术获得cDNA全长。获得的CpCPC的cDNA全长为640bp,其中开放阅读框228bp,编码75个氨基酸残基,以DNA为模板,使用特异引物克隆得到大约1800bp左右的片段,与cDNA序列进行比对发现该序列含有两段内含子,且均属于GT-AG型内含子。对蛋白序列进行信息学分析,结果表明该蛋白没有信号肽,主要以52.63%的随机卷曲和46.05%的α-螺旋构成,在叶绿体内大量存在。该蛋白存在9个丝氨酸磷酸化位点、2个苏氨酸磷酸化位点和1个酪氨酸磷酸化位点。2.CpCPC表达的转录水平分析实时荧光定量分析表明CpCPC基因在蜡梅的幼嫩叶片中表达量最高,在根和雄蕊、雌蕊中的表达量最低。在3轮花器官中的表达分析表明在外瓣和中瓣中的表达量较高,雌蕊、雄蕊中表达量较低。花发育时期的表达分析表明该基因在花发育过程中盛开及衰败其表达最高,其他时期表达量相对较低。3.CpCPC基因在烟草中的超表达构建植物超表达载体pCAMBIA2301g-CpCPC,并转化农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的叶盘法将pCAMBIA2301g-CpCPC转入烟草植株中,通过抗性筛选、Gus组织化学染色、PCR扩增等方法获得阳性转基因烟草植株。提取转基因烟草以及野生型烟草叶片中的类黄酮进行含量测定,对比其含量发现转基因植株中类黄酮较野生型有所减少,且与CpCPC基因的表达量基本呈负相关,说明CpCPC可能对类黄酮物质的合成起到负调控的作用。用体式显微镜观察转基因植株的根毛,并与野生型烟草对比,发现CpCPC基因超量表达的转基因植株根毛密度明显增加,而且长度加长,说明CpCPC在烟草中的异位表达可能影响根毛的发育。
【作者】王晓斌；
【导师】李名扬；
【作者基本信息】西南大学，园艺学，2014，硕士
【关键词】蜡梅；CpCPO；基因表达分析；转基因烟草；

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