巴氏新小绥螨对甲氰菊酯抗性分子机理研究

【摘要】巴氏新小绥螨Neoseiulusbarkeri是当前控制橘园柑橘全爪螨的一种有效生防物。通过选育巴氏新小绥螨的抗性品系,可以较好的解决化学防治和生物防治之间的矛盾,有助于田间的害虫综合治理。因此,本研究以巴氏新小绥螨为研究对象,在室内使用甲氰菊酯对其进行长时间汰选,并获得抗性品系；在此基础上,利用高通量测序技术,对其转录组进行深度测序；在筛选获得抗性相关基因的基础上,利用克隆和qPCR手段对上述基因进行基因突变及表达水平的检测,明确其变化规律,以期从分子水平阐明其抗性机理,为天敌的分子改造,特别是抗性的获得提供理论基础。本研究所获得的主要研究成果如下：1.巴氏新小绥螨甲氰菊酯抗性选育及其生态适合度评价在室内测定不同药剂对巴氏新小绥螨毒力,发现菊酯类农药对巴氏新小绥螨的毒力较大,因此本实验选择甲氰菊酯为筛选试剂进行抗性选育。我们在室内以甲氰菊酯LC50的50%浓度对巴氏新小绥螨连续处理多代,其LCso出现显著上升,由35.79mg/L提高到了22190.91mg/L,最终得到了抗性倍数为619.96倍的巴氏新小绥螨甲氰菊酯抗性品系。在此基础上,研究了巴氏新小绥螨甲氰菊酯抗性品系的交互抗性,结果表明,巴氏新小绥螨甲氰菊酯抗性品系对高效氟氯氰菊酯、毒死蜱、乙螨唑和噻虫嗪存在中等交互抗性,其抗性倍数分别为45.89、19.10、11.45和10.32倍。进一步研究甲氰菊酯抗性获得对巴氏新小绥螨的发育历期、繁殖力与捕食量的影响。结果表明：甲氰菊酯抗性的获得对巴氏新小绥螨的发育历期、每雌总产卵量均有较为明显的影响,而在每雌日产卵量、捕食量及孵化率方面均没有明显影响。研究不同药剂对抗敏品系孵化率的影响发现,多数药剂对巴氏新小绥螨抗敏品系的孵化率影响较小。而经哒螨灵、丁氟螨酯、高效氟氯氰菊酯处理后,其抗敏品系间会产生显著性差异（P<0.05）。2.巴氏新小绥螨转录组测序及抗性相关基因分析本实验通过利用下一代测序技术得到了巴氏新小绥螨的转录组数据库。共得到50,462条Transcripts和34,211条Unigenes.将得到的Unigenes提交NCBI蛋白质数剧库（Nr）进行BLASTP比对,设阈值为E=10-3,34,211个Unigenes中,共有15,987个返回有效结果。此外,还在其它数据库中进行了Unigenes的注释工作,其中在Swiss-Prot数据库比对成功的Unigenes为10,486个,在KEGG数据库中比对成功的Unigenes为5,445个,在GO数据库中比对成功的Unigenes为8,707个,在COG数据库中比对成功的Unigenes为5,673个。综合以上所有数据库的比对结果,共有15,987个Unigenes得到成功注释。3.巴氏新小绥螨电压门控钠离子通道的基因克隆及差异性分析在巴氏新小绥螨转录组数据库中找到了3条与钠离子通道基因相关的Unigenes,分别是comp28931c2、comp28931c3和comp28696c0.利用PCR技术和相关分子生物学软件对其序列进行生物信息学特性进行注释。我们最终克隆得到了1条长度为6175bp,编码2058个氨基酸的钠离子通道基因。同源性比对发现,巴氏新小绥螨与西方盲走螨（GenBankAccessionNo.XP003741737）和狄氏瓦螨（GenBankAccessionNo.AAP13992）的钠离子通道基因的同源性高达91.04%和80.48%,而与果蝇（GenBankAccessionNo.AAB59195）和人类（GenBankAccessionNo.NP066287）钠离子通道基因的同源性也分别达到了55.09%和41.98%。克隆得到的序列包含钠离子通道全部相关序列的所有典型特征。通过比较巴氏新小绥螨甲氰菊酯抗敏品系间钠离子通道基因的差异,我们共获得了5个SNPs（singlenucleotidepolymorphisms）位点,它们主要是A和G的互换。其中由G突变为A的分别位于3228和3243,由A突变G为的分别位于3844、4730和4874三个位点。通过翻译发现钠离子通道基因共有3处氨基酸突变,分别为S1282G、H1577R和E1665G,表明钠离子通道基因的突变可能是甲氰菊酯抗性产生的主要原因。4.巴氏新小绥螨内参基因筛选及代谢相关基因表达差异分析选取β肌动蛋白（ACTB）,微管蛋白α链（TUBA）,延伸因子α链（ELF1A）,核糖核酸聚合酶Ⅱ亚组（RNAPⅡ）,28S核糖体核糖核酸（28SrRNA）,热激蛋白90（Hsp90）,热激蛋白70（Hsp70）,热激蛋白40（Hsp40）,甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）,泛素结合酶（UBC）作为候选内参基因,以GeNorm、NormFinder和Bestkeeper软件分析上述10个基因在巴氏新小绥螨甲氰菊酯抗敏品系间的表达稳定性。利用GeNorm软件分析后,其表达稳定度由高到低排序依次为ACTB=UBC>Hsp40>Hsp70>GAPDH>ELF1A>Hsp90>TUBA>28srRNA>RNAPⅡ.通过NormFinder软件计算各内参基因的稳定度值稳定性由高到低为：ACTB>UBC>Hsp70>Hsp40>GAPDH>ELF1A>TUBA>Hsp90>28SrRNA>RNAPⅡ,其中表达最稳定的依然是ACTB.BestKeeper软件评价结果与NormFinder和GeNorm结果基本一致,其稳定性由高到低依次为ACTB>UBC>Hsp70>GAPDH>ELF1A>Hsp40>Hsp90>TUBA>28SrRNA>RNAPⅡ.综合3种软件结果,巴氏新小绥螨敏感品系和甲氰菊酯抗性品系之间最为理想的内参基因是ACTB,为下一步qPCR实验顺利进展奠定基础。通过在转录组中分析比对,整理出与代谢相关的P450s、CarEs和GSTs基因,利用相关信息学分析软件及qPCR技术,我们发现巴氏新小绥螨共有32条P450基因,其中隶属于Clan2中有9条,Clan3中有多达19条,Clan4和ClanM均为2条；通过定量实验进行验证发现Clan4中的comp24004c0和comp32672c0以及Clan2中的comp29873c0和comp24471c0表达量分别在抗性品系中上调46.69、32.90、3.03和1.96倍。显著性分析比较表明,comp24004c0和comp32672c0均出现显著性上调（P<0.05）。巴氏新小绥螨中共有14条CarEs基因,它们分布于3个基因家族,分别是CladeJ、CladeK和CladeL;通过定量验证发现共有7条基因上调,7条基因下调。其中comp21521c0匕调倍数最大，上调倍数为3.52倍,其次是comp30704c0,它的上调倍数为2.69倍,其它基因的上调倍数均小于2倍。此外,发现GST有11条,其中Delta家族基因有3条,而Kappa、Mu和Omega家族基因分别为2、2和4条；qPCR验证结果表明Delta家族的3条基因GSTd01,GSTd02和GSTd03均出现显著性上调,分别上调11.19、5.43和4.04倍。本实验结果表明P450基因comp24004c0和comp32672c0的上调倍数较大,这两条基因极有可能参与了甲氰菊酯的代谢过程。综上所述,本研究利用室内生测技术选育获得巴氏新小绥螨甲氰菊酯抗性品系,同时评估了该抗性品系对巴氏新小绥螨甲氰菊酯抗性品系的交互抗性。应用高通量测序技术对巴氏新小绥螨完成转录组测序任务与注释。此外,利用RT-PCR手段和相关分子生物学软件,完成了巴氏新小绥螨钠离子通道基因的克隆与分析,发现该序列突变位点,同时运用qPCR技术评价了巴氏新小绥螨甲氰菊酯抗敏品系间内参基因的稳定性,在此基础上,分析了P450、CarE和GST基因在不同品系之间的表达差异。本研究结果不仅丰富了捕食螨的抗性材料,而且从分子层衙上比较了巴氏新小绥螨甲氰菊酯抗敏品系间的差异,为巴氏新小绥螨抗性分子机理的研究奠定了基础。
【作者】陈飞；
【导师】冉春；
【作者基本信息】西南大学，农药学，2014，硕士
【关键词】巴氏新小绥螨；甲氰菊酯；钠离子通道基因；代谢酶基因；表达水平；

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