胰高血糖素受体的生物化学及生物物理特性分析

【摘要】胰高血糖素(Glucagon,Gc)是人体内调节血糖浓度的重要肽类激素之一其主要生理作用是通过调节糖异生和糖原分解来升高血糖。胰高血糖素的受体(Glucagonreceptor,GCGR)在人体各种组织器官中广泛分布,但主要位于肝细胞膜表面,是G蛋白偶联受体(Gproteincoupledreceptor,GPCR)超家族中家族B的典型代表,属于七次跨膜蛋白,其胞外区(Extracelluardomain,ECD)是与胰高血糖素结合的主要结构域。现在有很多研究认为人体内胰高血糖素浓度过高是促使糖尿病发生发展的重要因素,甚至被认为是2型糖尿病病理生理过程中的中心环节。已经在糖尿病动物模型中证实胰高血糖素受体的拮抗性抗体或小分子可以明显降低血糖浓度,因此拮抗胰高血糖素的作用可能成为治疗2型糖尿病的新领域。获得胰高血糖素受体与其配体结合的结构信息,不仅可以揭示这类重要受体发挥功能的分子机制,更加有助于我们更好地设计出合理的药物,应用于糖尿病及其他代谢病的治疗。因此,我们期望可以解析胰高血糖素受体胞外区(GCGR-ECD)及其与胰高血糖素结合的结构,并应用于生物医药领域。在本论文中,作者综合运用了各种表达及纯化手段,尝试了大肠杆菌表达系统和昆虫细胞表达系统。最终在大肠杆菌OrigamiB宿主菌中纯化出MBP(麦芽糖结合蛋白,Maltosebindingprotein)融合的GCGR-ECD重组蛋白,并且创新性的将胰高血糖素小肽融合在此蛋白的羧基末端(命名为GCGR-ECD-Gc),使Glucagon可在分子内部与GCGR-ECD结合。另一方面,作者在昆虫表达系统中分泌性表达了GCGR-ECD,并筛选出了一种可以大大提高蛋白表达量的信号肽。作者第一次在体外应用等温量热滴定法(Isothermaltitrationcalorimetry,ITC)检测了重组GCGR-ECD蛋白与胰高血糖素的结合力,原核表达蛋白的平衡解离常数值(Kd)为7.6μM,真核蛋白则为6.6μM,并用ITC证明了MBP融合的GCGR-ECD-Gc蛋白可以在分子内部形成受体-配体的结合,是进行下一步X射线晶体学研究的良好对象。作者通过各种生物物理方法检测了各类重组蛋白质的二级结构特点及稳定性,并大量尝试了结晶筛选。虽然结晶实验没有成功,但作者发现这类重组蛋白结晶困难的主要因素。最后,作者提出了可能的改进方法以及手段,可供后续研究参考。本论文在阐述GCGR-ECD的研究之后总结了目前GPCR研究领域的进展,包括GPCR的最新研究方法,以及各类GPCR的结构生物学研究概况。
【作者】吴丽莉；
【导师】王庆华；孙飞；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【副题名】胞外区的重组表达、结晶筛选和功能测定
【关键词】胰高血糖素受体；G蛋白偶联受体；胞外区；MBP融合蛋白；昆虫表达；等温滴定量热法；

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