皮肤源性前体细胞体外分化与细胞体内移植延缓失神经肌肉萎缩的实验研究

【摘要】第一部分：GFP转基因大鼠皮肤源性前体细胞体外向神经元样细胞分化及表达神经营养因子的实验研究目的：研究从成体GFP转基因大鼠背部皮肤分离、体外增殖皮肤源性前体细胞(skin-derivedprecursors,SKPs)的方法,并探讨皮肤源性前体细胞的生物学特性。在体外条件下,将皮肤源性前体细胞诱导分化为神经元样细胞,研究皮肤源性前体细胞以及诱导分化成神经元样细胞后神经营养因子的表达情况。方法：从GFP转基因大鼠背侧皮肤分离细胞后,在促分裂剂碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)和表皮生长因子(EGF)存在的条件下悬浮培养。行细胞标志物巢蛋白(nestin),纤维连接蛋白(fibronectin),β-tubulinⅢ、Sox2、经丝蛋白(neurofilament,NF)、微管相关蛋白2(microtubuleassociatedprotein2,MAP2)免疫荧光染色和流式细胞仪检测。传3代后,皮肤源性前体细胞经含有神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)等的诱导分化剂诱导分化2-4周。分别在诱导分化前和诱导分化后3周时采用RT-PCR测定皮肤源性前体细胞和皮肤源性前体细胞体外向神经元分化的细胞神经营养因子BDNF、NGF、睫状神经营养因子(CNTF)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的表达情况。结果：大鼠皮肤源性前体细胞可采用从脑内分离神经干细胞相类似的方法从GFP大鼠背侧皮肤获得。所获得并体外增殖形成的细胞神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)染色阳性,神经元标志物β-tubulinll阳性。皮肤源性前体细胞还表达一种骨髓间充质干细胞产生的纤维连接蛋白,但却不表达神经嵴干细胞标志物p75神经营养素受体(p75NTR)以及多唾液酸-神经细胞黏附分子(PSA-NCAM)。皮肤源性前体细胞可以同时表达巢蛋白和纤维连接蛋白(fibronectin)。传3代后,仍有60%以上的细胞呈现巢蛋白染色阳性。分别从成体表皮、真皮和坐骨神经分离获得细胞在相同培养条件下,仅有真皮中分离出细胞能增殖、悬浮生长并成球,并且也同时表达巢蛋白和纤维连接蛋白。皮肤源性前体细胞经体外培养前就已经存在于真皮组织中。皮肤源性前体细胞与间充质干细胞不同,表现在皮肤源性前体细胞不表达波形蛋白(vimentin)和细胞角蛋白(cytokeratin)。皮肤源性前体细胞可被诱导分化为皮肤组织中原本并不存在的神经元样细胞,nestin、β-tubulinⅢ、神经丝(neurofilament,NF)和微管相关蛋白2(microtubuleassociatedprotein2,MAP2)免疫荧光染色阳性。无论皮肤源性前体细胞或其诱导分化成的神经元样细胞在体外环境中均表达神经营养因子BDNF、NGF、GDNF和CNTF。结论：皮肤源性前体细胞是一种内源性的前体细胞。可同时表达巢蛋白和纤维连接蛋白的皮肤源性前体细胞可从成体真皮组织中获得,其与间充质干细胞有本质区别。在特定条件下,皮肤源性前体细胞可被诱导分化为神经元样细胞,表达成熟神经元标志物。皮肤源性前体细胞及其诱导分化成的神经元样细胞均能表达神经营养因子。皮肤源性前体细胞代表了一种新型的易获得、可增殖、可诱导成神经元样细胞的干细胞。第二部分：皮肤源性前体细胞在周围神经内存活及皮肤源性前体细胞体外诱导分化为神经元样细胞在周围神经内存活的实验研究目的：研究皮肤源性前体细胞和皮肤源性前体细胞体外诱导分化的神经元样细胞体内移植,移植时机、移植周围微环境对移植细胞存活率的影响,以及移植细胞在损伤的周围神经中神经营养因子的表达情况。方法：根据可能导致细胞生存微环境改变的因素,将受体模型Lewis大鼠随机分为胫神经未损伤组和胫神经损伤组。将建立周围神经损伤模型的Lewis大鼠胫神经在其进入腓肠肌以上1厘米处横断,并造成0.5厘米的神经缺损,然后将横断神经的远、近端分别加橡皮帽封闭。胫神经损伤组中,又随机分为四个实验组：胫神经切断即刻,皮肤源性前体细胞直接注射组；肌肉萎缩产生后,培养液注射组；肌肉萎缩产生后,皮肤源性前体细胞注射组；肌肉萎缩产生后,皮肤源性前体细胞体外诱导分化的神经元样细胞注射组。分别在细胞移植术后第4、8、12周,取标本,采用免疫荧光染色定性分析皮肤源性前体细胞以及皮肤源性前体细胞体外诱导分化的神经元样细胞在体内表达神经营养因子BDNF、NGF、GDNF和CNTF的情况。结果：与皮肤源性前体细胞移植入损伤的周围神经中相比,将皮肤源性前体细胞移植入完整的未损伤的周围神经中,其存活率明显降低。在损伤的周围神经环境中,急性损伤后较慢性损伤后移植细胞存活率高。将皮肤源性前体细胞和皮肤源性前体细胞诱导分化的神经元样细胞分别移植入离断胫神经的远端,术后不同时间点观察,两种细胞均能在体内存活,且在各时间点后者细胞存活率较前者高。在术后第4、8、12周取材,两种细胞在损伤的周围神经中的存活率随时间推进均明显下降。在细胞移植术后第12周时,皮肤源性前体细胞和其诱导分化的神经元样细胞在损伤的周围神经中均仍然存活,且在体内亦均表达神经营养因子BDNF、NGF、GDNF和CNTF。结论：皮肤源性前体细胞在不同的周围神经环境中表现出不一样的细胞存活率。皮肤源性前体细胞和其诱导分化的神经元样细胞在损伤的周围神经中至少可以存活12周。体外将皮肤源性前体细胞诱导分化成神经元样细胞可以提高移植术后细胞在损伤周围神经中的存活率。皮肤源性前体细胞和其诱导分化的神经元样细胞在体内均可表达神经营养因子。今后可在此基础上研究皮肤源性前体细胞和其诱导分化的神经元样细胞对促进神经再生、延缓失神经骨骼肌萎缩的作用。第三部分：皮肤源性前体细胞及其体外诱导分化成的神经元样细胞移植延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究目的：研究皮肤源性前体细胞和皮肤源性前体细胞诱导分化的神经元样细胞移植对失神经骨骼肌萎缩的作用。方法：将胫神经损伤模型受体组每一只Lewis大鼠胫神经在其进入腓肠肌以上1厘米处横断,并造成0.5厘米的神经缺损,然后将横断神经的远、近端分别加橡皮。一周后,随机将受体大鼠分为三组,分别注射培养液、皮肤源性前体细胞、皮肤源性前体细胞体外诱导分化的神经元样细胞。在细胞移植术后第4、8、12周先对大鼠行步态分析,然后分别取腓肠肌和胫神经测定腓肠肌张力、肌张力、肌肉横截面积维持率、神经内轴突数量,有髓神经纤维密度、G比值等,并对肌肉组织行Mallory三色染色分析其组织纤维化程度。结果：皮肤源性前体细胞和皮肤源性前体细胞诱导分化的神经元样细胞移植后均能促进腓肠肌萎缩后下肢功能的恢复。皮肤源性前体细胞、皮肤源性前体细胞诱导分化的神经元样细胞和对照组相比均能延缓失神经支配骨骼肌萎缩。皮肤源性前体细胞诱导分化的神经元样细胞延缓骨骼肌萎缩效果略好于皮肤源性前体细胞。结论：皮肤源性前体细胞和皮肤源性前体细胞诱导分化的神经元样细胞在大鼠模型中可以延缓失神经骨骼肌萎缩,尽管其延缓肌肉萎缩的具体机制仍不十分明了,但将皮肤源性前体细胞预先体外诱导分化为神经元样细胞再行体内移植对延缓失神经骨骼肌萎缩效果明显增强。
【作者】徐静；
【导师】徐建光；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】皮肤源性前体细胞；神经元样细胞；移植；神经营养因子；肌肉萎缩；

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