TTRAP影响肿瘤细胞生长和依托泊苷药物敏感性的分子机理初步研究

【摘要】DNA损伤修复与肿瘤的发生、发展密切相关,其中的关键分子和信号通路是抗肿瘤药物研究和开发的重要靶点。TTRAP(TRAFandTNFreceptor-associatedprotein)是一个新鉴定的5’-酪氨酰DNA磷酸二酯酶,在细胞发生DNA损伤时,可将双链断裂缺口处5’端的磷酯酪氨酰键水解转化为5’磷酸,促进DNA双链断裂修复。本论文旨在研究TTRAP对肿瘤细胞生长和化疗药物敏感性的影响,探讨其能否作为肿瘤辅助治疗的靶标。为确定TTRAP是否与肿瘤发生有关,我们检索了TTRAP在基因表达综合库中的数据,发现在早期发病的结直肠癌患者结肠黏膜和恶性转化的前列腺癌患者肿瘤内TTRAP表达量均较低。检测肺癌、乳腺癌、前列腺癌及骨肉瘤等多种肿瘤细胞株的TTRAP蛋白表达谱,发现TTRAP在所有细胞中普遍存在,但其表达形式和表达丰度在各细胞株中存在较大差异。在内源TTRAP表达量相对较低的人骨肉瘤细胞株U20S中,过表达野生型TTRAP(TTRAPwildtype,TTRAPwt)显著抑制U20S细胞的克隆形成。稳定转染TTRAP的细胞株在持续6天的生长曲线中显示生长变缓。表达TTRAP酶活性的无功能突变体TTRAP(E152A)及TTRAP(D262A)可部分缓解这种抑制作用。TTRAPwt的过表达对NF-κB的转录活性有抑制作用,该作用可被突变体TTRAP(E152A)及TTRAP(D262A)的表达所抵消。TTRAP也可抑制U20S细胞迁移,但TTRAP酶活性的突变对这一作用没有影响。上述结果提示TTRAP对肿瘤细胞有生长抑制作用,这种抑制作用依赖于其5’-酪氨酰DNA磷酸二酯酶活性,可能与NF-κB信号通路相关。TP53是DNA损伤反应中决定细胞命运的关键蛋白。为探讨TTRAP影响肿瘤细胞生长的分子机制,我们应用酵母双杂交鉴定了TTRAP与TP53的直接相互作用。TP53的截短突变体与TTRAP的酵母配对实验结果表明,TP53的DNA结合域与两者间的相互作用有关。免疫共沉淀实验证实293T细胞内源表达的TP53和TTRAP存在相互作用。荧光蛋白融合体EGFP-p53和TTRAP-DsRed可共定位于细胞核内,表明TTRAP和TP53在空间上存在相互作用的可能。应用萤光素酶报告基因检测TP53对下游靶基因的转录调控作用,在低水平表达TP53的情况下,TTRAP促进TP53对下游基因的转录激活作用。依托泊苷是临床常用的抗肿瘤药物,通过干扰拓扑异构酶2(topisomerase2,Top2)介导的DNA再连接反应使DNA双链断裂。体外药物敏感性研究表明,U20S细胞过表达TTRAPwt后,依托泊苜处理使其克隆存活率显著高于空载体对照；细胞内源TTRAP用siRNA沉默表达,药物处理后的克隆存活率低于对照。在细胞增殖实验中,U20S细胞过表达TTRAPwt后对依托泊苷的细胞毒效应低于空载体对照,而过表达TTRAP(E152A)和TTRAP(D262A)后其效应高于对照。这表明TTRAP的表达量与U20S细胞对依托泊苷的药物敏感性呈负相关。为进一步探讨TTRAP与依托泊苷细胞杀伤效应的相关性,我们检测了药物处理情况下TTRAP转录和蛋白表达的动态变化,发现依托泊苷处理1-6小时内TTRAP的转录没有显著提高,但其蛋白量有所增加。以亚胺环己酮(cycloheximide,CHX)抑制细胞内蛋白质合成时,TTRAP的蛋白表达量在1-9小时内逐渐减少,而同时加CHX和依托泊苷处理,细胞内TTRAP蛋白降解速度减缓,表明依托泊苷处理提高了TTRAP蛋白的稳定性,减缓了蛋白的降解过程。因翻译后修饰(post-translationalmodifications,PTM),如泛素化和SOMO化情况的变化会影响蛋白稳定性,依托泊苷对’TTRAP蛋白稳定性的影响可能涉及蛋白的泛素化抑制和SOMO化激活,其具体机理还需要进一步实验验证。SUMO非共价结合也属于蛋白翻译后修饰的一种。将TTRAP基因中的SUMO蛋白非共价结合位点突变后与红荧光基因融合后构建成融合蛋白表达质粒pTTRAP(SIMm)-DsRed,该质粒在细胞内的表达量显著下降,且不再呈现PML核体典型的点状分布特征,说明SUMO蛋白的结合对TTRAP蛋白在细胞内的稳定表达和亚细胞定位起着重要作用。综上所述,本论文发现了TTRAP对U20S肿瘤细胞的生长有抑制作用,U20S细胞对抗肿瘤药物依托泊苷的敏感性与TTRAP的表达量呈负有关。上述结果表明对TTRAP表达和活性的调节有助于改善肿瘤细胞对依托泊苷的药物敏感性,为TTRAP应用于肿瘤的辅助治疗提供了初步的实验和理论依据。
【作者】周彩红；
【导师】薛京伦；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2010，博士
【关键词】TTRAP；拓扑异构酶2；依托泊苷；药物敏感性；翻译后修饰；SUMO；

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