基于适配体和抗体功能化纳米材料的疾病标记蛋白质分离分析新方法研究

【摘要】对疾病相关蛋白质进行定性、定量和结构表征有利于揭示疾病过程中蛋白质活动规律,阐明疾病发生、发展的机制,是蛋白质组学研究领域中十分重要的课题。监控疾病分子标志物的水平有助于为疾病的早期诊断,治疗监控和疾病的预后提供依据,在临床上也具有重大的意义。但是分子标记物在体液中存在的浓度很低,直接对其进行分析和检测难度很大。常规的方法是采用ELISA等基于抗体的技术对低丰度的分子标志物进行富集。而利用纳米材料特殊的光学、电学、荧光、催化以及大比表面积等性质发展更加灵敏、简单、快速的生物分子分析检测方法,是近些年来的研究趋势。核酸适配体作为一种抗体的替代物,因其价格低廉、易于合成、性质稳定和等优点而被广泛应用在疾病分子标志物的检测中。本论文结合疾病分子标志物检测领域的难点和热点,创新性地发展了一系列基于适配体和抗体的功能化纳米材料,并结合MALDI-TOF质谱技术对其进行定性和定量,实现了对疾病蛋白分子标志物高灵敏、高通量的分析和检测。全文共分五章,主要内容如下：第一章,文献综述。本章总结了基于抗体和适配体的蛋白质分析检测方法近些年来的进展,介绍了亲和MALDI-TOF质谱技术在分子标志物检测中的应用,阐述了本论文的选题意义。第二章,适配体修饰的Fe3O4@C@Au用于凝血酶的选择性富集和检测。本章中我们用静电吸附-层层自组装方法把金纳米颗粒通过静电作用吸附在修饰了PDDA的磁球表面,合成了Fe3O4@C@Au材料。该方法比传统的磁球包金材料的合成方法更为简单。然后,通过巯基将适配体固定在该材料的表面,并用于选择性地富集低浓度的凝血酶。通过胰蛋白酶酶解和质谱分析,采用其中一条丰度最高的肽段m/z=1194.6来对凝血酶进行定性和定量。通过使用内标肽,在标准溶液中0.5nM-10nM之间获得了线性曲线,R2=0.99。检测限为0.36nM。其他蛋白包括人血清白蛋白,转铁蛋白,免疫球蛋白,鸡卵白蛋白和胎牛血清均不影响凝血酶的检测。血清加样回收的实验也表明我们能成功从血清中回收凝血酶。该方法为目标蛋白的分离、分析和选择性检测提供了新的思路。第三章,适配体阵列用于靶上快速富集和检测胰岛素。我们通过简单、有效地方法在MALDI靶板表面修饰了致密、牢固、多孔的金膜,并用于固定巯基化的胰岛素适配体,形成适配体阵列,实现了胰岛素的靶上快速灵敏的富集和检测。无内标条件下在标准溶液中建立了线性曲线,并且可得到5ng/mL的检测限。利用猪胰岛素作为内标,成功在10倍稀释的血清中建立线性曲线,并可得到20ng/mL的检测限。比目前已经报道的胰岛素适配体检测方法灵敏度更高。该方法尤其适合于大量样品的、高通量的分离、分析和定量,在分子标记物的检测中有着广泛的应用前景。第四章,适配体阵列结合靶上激光酶解用于溶菌酶的快速富集和高效检测。在本章中,我们首次设计了靶上适配体阵列富集-激光酶解-MALDI-TOFMS的方法来用于高通量、高灵敏度的溶菌酶的富集和检测。首先,我们延续第三章的方法,成功地在靶板的表面修饰了稳定、致密、多孔的金膜用于适配体的固定；其次,通过靶上富集和激光加速酶解,能够实现低丰度的溶菌酶的富集和高效酶解：最后利用MALDI-TOF质谱进行分析。通过加入目标肽段的结构类似物作为内标,我们在标准溶液中建立了线性曲线,并得到了14ng/mL的检测灵敏度,与目前国际上最好的检测方法在同一水平。在无稀释的尿样中实现了对内源性溶菌酶的检测,通过标准加入法建立了尿样中的线性曲线,并计算出尿样中的检测限可达66ng/mL,尿样中内源性溶菌酶浓度为125ng/mL。我们成功地从血清中回收溶菌酶,并且检测到了血清中内源性的溶菌酶。总之,该方法快速、灵敏、选择性好,有望于在将来大规模的检测中得到广泛的应用。第五章,双抗夹心探针放大技术对甲胎蛋白检测的初步探索。我们创新性地提出了发展双抗夹心探针放大技术对肝癌分子标记物AFP进行检测的思路。我们首先将抗体固定在磁球上,并通过比较各种固定方法并优化条件,最终选择利用抗体糖链进行定向固定,能够实现对低浓度AFP的完全回收。然后,我们成功地在纳米胶体金的表面同时修饰上第二种抗体和标签肽。通过洗脱金胶上的标签肽,进入质谱分析,可以对底物进行定量。本方法首次提出用高灵敏质谱响应的肽作为标签,形成抗原-抗体复合物后,一个底物将对应多个肽段,使信号得以放大,有望实现AFP蛋白质高灵敏检测。综上所述,本论文围绕疾病分子标志物检测领域的难点和热点,结合适配体、纳米材料和质谱技术成功发展了一系列灵敏、快速的检测方法。并利用抗体和标签肽,创新性地提出双抗夹心探针放大技术对AFP进行检测的思路,对肝癌分子标志物AFP的检测和质谱信号的放大做出了有意义的尝试。我们的方法有望于在将来在临床分析检测领域得到应用与发展。
【作者】张学洋；
【导师】张祥民；
【作者基本信息】复旦大学，分析化学，2013，博士
【关键词】适配体；抗体；磁性纳米材料；纳米金胶；MALDI-TOF；质谱；定量；富集凝血酶；溶菌酶；胰岛素；激光酶解；甲胎蛋白；

【参考文献】
[1]许磊.加权酉变换类—混沌图像加密系统研究[D].哈尔滨工业大学,应用数学,2014,硕士.
[2]铁坤.民间借贷的立法研究[D].华东政法大学,民商法学,2012,硕士.
[3]陈晓.基于生态经济学模型的新疆可持续发展度量研究[D].新疆大学,2005.
[4]郑海霞.心理距离和特质词效价对自发特质推理的影响[D].湖南师范大学,基础心理学,2014,硕士.
[5]林冠男.考虑残差相关性的期货投资组合动态保证金水平设定[D].山东大学,金融学,2013,硕士.
[6]代高琴.轻钢结构住宅的生命周期成本评价与研究[D].长安大学,技术经济及管理,2013,硕士.
[7]万鹏.长江中游棉区转Cry1A基因棉花杀虫蛋白表达及对靶标和非靶标害虫的影响[D].中国农业科学院,农业昆虫与害虫防治,2004,硕士.
[8]陈凯.陇中黄土高原紫花苜蓿地土壤干层形成及其恢复效应研究[D].甘肃农业大学,作物栽培学与耕作学,2013,硕士.
[9]曹瑞恒.关联数据驱动的文档注释系统的设计与实现[D].哈尔滨工业大学,软件工程,2013,硕士.
[10]杨硕.河北省一事一议财政奖补制度建设研究[D].燕山大学,行政管理,2014,硕士.
[11]谭志中.加强型多边形电阻或电容网络的等效值研究[J].大学物理,2011,12:29-32+37.
[12]杨阳.中年人主观幸福感及其与应对方式关系的研究[D].扬州大学,应用心理学,2012,硕士.
[13]时秋月.怀山药低温保鲜干燥试验研究[D].河南科技大学,食品科学,2014,硕士.
[14]吕良.OFDM系统中信道估计及相关技术研究[D].西安电子科技大学,控制理论与控制工程,2012,硕士.
[15]崔展.Vaspin与冠心病的相关性研究[D].苏州大学,内科学,2013,硕士.
[16]周鹏杰.精神分裂症脑功能连接数据的分类方法研究[D].湖南大学,计算机科学与技术,2012,硕士.
[17]宋健.天麻素骨架缓释片的制备及体外释药性研究[D].山东大学,制药工程（专业学位）,2012,硕士.
[18]李建茹.内蒙古乌梁素海浮游植物群落特征及生态模拟研究[D].内蒙古农业大学,农业水土工程,2014,博士.
[19]李建华,王渊,蒋国顺,李战鹰,黄莹.高压直流输电系统谐波计算软件包开发与应用[J].电力系统自动化,2009,04:96-99.
[20]张梨梨.格尔木—南山口铁路沿线土地利用/覆盖变化研究[D].中国地质大学（北京）,测绘工程,2014,硕士.
[21]李剑.基于linux的嵌入式点菜系统终端[D].浙江大学,2006.
[22]耿立馨.合流制管道沉积物冲刷模型试验研究[D].武汉理工大学,市政工程,2013,硕士.
[23]石慧.论保险法中的不可抗辩条款[D].浙江工商大学,民商法,2012,硕士.
[24]苏健.黑龙江东南部高校中年教师体育锻炼现状及干预研究[D].牡丹江师范学院,体育教育训练学,2012,硕士.
[25]马晶晶,黄博文,何雨石,马紫峰.一步原位合成3D石墨烯/CoO复合材料及其储锂能力[A].中国电子学会化学与物理电源技术分会、中国化学与物理电源行业协会、中国电工技术学会氢能发电装置专业委员会、中国电工技术学会电池专业委员会、化学与物理电源重点实验室.第30届全国化学与物理电源学术年会论文集[C].中国电子学会化学与物理电源技术分会、中国化学与物理电源行业协会、中国电工技术学会氢能发电装置专业委员会、中国电工技术学会电池专业委员会、化学与物理电源重点实验室:,2013:1.
[26]王艳芳.大学生认知风格、创意效能感与创造力的关系[D].济南大学,发展与教育心理学,2012,硕士.
[27]谌卓恒,付全全.一种估计未发现构造圈闭个数及圈闭面积大小分布的概率模型[J].石油地球物理勘探,1996,S1:125-128+148.
[28]范梦峥.中国价格听证制度研究[D].西南政法大学,宪法学与行政法学,2012,硕士.
[29]宋利君.漓江流域脆弱性生态系统评价及其与旅游业的协调发展研究[D].广西师范大学,旅游管理,2013,硕士.
[30]刘志波.基于监控视频的值班员状态检测方法研究[D].国防科学技术大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[31]孟跃红,黄智.数据仓库技术在高校教育管理中的应用[J].徐州师范大学学报(自然科学版),2003,02:69-71+78.
[32]张乐华,张华阳,李冲,贾丽萍,王怀生.普鲁士蓝/PDDA-石墨烯复合膜修饰电极的制备及应用于过氧化氢无酶传感器[J].传感技术学报,2014,04:438-445.
[33]于媛.基于Web的勤工助学管理系统的设计与实现[D].西安工业大学,计算机技术,2014,硕士.
[34]范红菊.地铁车站暗挖施工对地表及邻近桥桩沉降的影响规律研究[D].西安科技大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[35]王志.直肠癌Dixon术中高位与低位结扎肠系膜下动脉的临床比较[D].兰州大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[36]李颢.路堑式坡残积土质边坡变形与稳定性的研究[D].福州大学,环境工程,2004,硕士.
[37]徐洪涛,王跃钢,杨波,陈国栋.非正交联合对角化的罚函数粒子群算法[J].控制与决策,2012,02:317-320.
[38]施湘君,张文君,俞传明.N,N-二异丙基乙二胺的合成工艺改进[J].浙江化工,2013,11:21-23+38.
[39]赵金清.数据仓库和数据挖掘技术在智能网管系统中的应用与研究[D].哈尔滨工程大学,2004.
[40]戴露思.B2B电子商务系统关键技术研究与实现[D].南京航空航天大学,2003.
[41]雷婷婷.大豆bZIP转录因子GmbZIP-32的克隆与功能鉴定[D].吉林大学,作物遗传育种,2013,硕士.
[42]郭海伟.钒配合物的合成、DNA键合、断裂及其抗癌活性研究[D].广东药学院,药物化学,2012,硕士.
[43]刘俊.中医综合治疗方案对肺心病缓解期生存质量与复发率的临床观察[D].湖南中医药大学,中医内科学,2014,硕士.
[44]罗柳金.瘦素对成年大鼠心肌细胞收缩功能作用及机制研究[D].广州医科大学,心血管药理学,2014,硕士.
[45]季建光.内蒙古自治区农牧区中小学教师教育技术能力状况的调查与分析[D].内蒙古师范大学,教育技术学,2012,硕士.
[46]李学军.幼儿园双语教学现状、问题及对策研究[D].山东师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[47]赵曼卡.现代汉语“反正”类语气副词研究[D].华中师范大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[48]沈诗剑.民间借贷中介的法律规制[D].上海大学,法律,2013,硕士.
[49]颜伟,宋林滔,余娟,卢健刚,李钦,张海兵.基于权函数的电网参数分区辨识与估计方法[J].电力系统自动化,2011,05:25-30.
[50]鲁建树.农村文化产业发展在新农村建设中的作用[D].华中师范大学,农村与区域发展,2014,硕士.