亚低温治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤的机制研究

【摘要】缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemicbraininjury,HIBI)是导致新生儿死亡及致残的重要原因。临床多中心研究结果已证实亚低温可有效治疗新生儿HIBI,然而其作用机制还有待进一步阐明。本课题采用动物实验和体外细胞培养等方法,研究在HIBI中亚低温对神经干细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞的作用,以深入探讨亚低温脑保护作用的机制。本研究分三部分。第一部分亚低温对缺氧缺血损伤脑神经干细胞的作用[目的]研究亚低温对新生大鼠缺氧缺血(Hypoxic-ischemia,HI)损伤脑不同区域神经干细胞的影响,探讨亚低温治疗对神经再生的作用及其机制。[方法]本课题采用7日龄新生大鼠制备HI模型,经过48小时亚低温(维持肛温32-33℃)或者常温(维持肛温36-37℃)处理后,分别于HI后7d和14d处死动物取材。采用腹腔注射BrdU标记新生细胞,免疫组化双标结合免疫荧光双标染色观察神经干细胞,幼稚神经元及成熟神经元的新生、凋亡和分化。通过构建慢病毒-绿色荧光蛋白载体并立体注射动物纹状体部位,观察亚低温干预后抑制Bcl-2的上调对神经干细胞及神经元凋亡的影响,从而探讨亚低温影响神经再生的可能机制。[结果]与常温组相比：1.亚低温虽不影响新生神经干细胞(BrdU+Nestin+)的数量,但明显增加HI后1、2周新生幼稚神经元(BrdU+Tuj-1+)及HI后2周新生成熟神经元(BrdU+Map-2+)的数目。此外,HI后1周和2周时,亚低温干预显著降低神经干细胞、幼稚神经元及成熟神经元的凋亡率。亚低温组纹状体区神经细胞抗凋亡因子Bcl-2表达增加,而侧脑室注射Bcl-2-RNAi可显著抑制Bcl-2的表达,且神经干细胞、幼稚神经元及成熟神经元的凋亡率有所回升。2.亚低温显著减少HI大鼠脑海马颗粒下区(SGZ)神经元(NeuN+)的丢失,而新生细胞(BrdU+)也显著下降。因此,虽然亚低温对SGZ神经干细胞(Nestin+)的数量没有明显影响,但显著增加了新生细胞向神经元方向分化的比例,减少新生细胞向星形胶质细胞及少突胶质细胞分化的比例。[结论]1.HI后亚低温干预可促进幼稚神经元和成熟神经元新生。2.抗凋亡因子Bcl-2的表达参与了亚低温抗神经细胞凋亡的作用。3.亚低温干预可促进新生细胞向神经元方向分化,减少其向星形胶质细胞和少突胶质细胞方向分化。第二部分亚低温对缺氧缺血损伤脑少突胶质前体细胞分化成熟的作用[目的]新生儿脑损伤后不仅存在大脑灰质损伤还有大脑白质的损伤。少突胶质细胞是大脑中包绕神经元轴突形成髓鞘的重要细胞。本部分研究通过动物实验和体外培养少突胶质前体细胞系,研究亚低温对缺氧缺血损伤后少突胶质前体细胞的发育成熟及髓鞘修复的影响。[方法]动物模型制备及亚低温干预同“第一部分”。动物分别于HI后1d、3d、7d、14d、42d处死并取材。采用腹腔注射BrdU标记增殖细胞,免疫荧光双标及免疫电镜观察髓鞘化轴突的损伤。此外,取胚胎14日龄大鼠培养神经干细胞并诱导分化成少突胶质前体细胞,经过氧糖剥夺试验后进行48h亚低温或常温培养,随后进一步分化至少突胶质细胞。通过免疫荧光双标检测少突胶质前体细胞的增殖率、分化率及凋亡率。通过western-blot检测成熟少突胶质细胞的分泌蛋白。[结果]与常温组相比：1.亚低温显著减少海马区神经元的丢失及其轴突损伤,并且早期少突胶质前体细胞(A2B5)显著增加,而晚期少突胶质前体细胞(04+)反而减少。进一步实验证明,亚低温处理明显减少晚期少突胶质前体细胞的凋亡率。此外,亚低温显著增加了海马区髓鞘合成相关蛋白PLP、GST-pi和MBP的表达,以及髓鞘化轴突的比例。2.亚低温显著增加胼胝体区早期少突胶质前体细胞(NG2)和新生细胞(BrdU)的数量,显著减少晚期少突胶质前体细胞(04)的数量,而增加了成熟少突胶质细胞特异蛋白MBP及PLP的表达。同样,亚低温显著抑制体外培养少突胶质前体细胞的凋亡,促进其分化成熟,而对细胞的增殖没有明显改变。此外,HI后亚低温明显增加胼胝体区髓鞘化轴突的数量,并改善动物的远期运动功能。[结论]1.亚低温可促进早期少突胶质前体细胞增殖,减少晚期少突胶质前体细胞聚集和凋亡,促进少突胶质前体细胞分化成熟。2.亚低温促进髓鞘的损伤修复并明显改善动物远期运动功能。第三部分亚低温对缺氧缺血损伤脑星形胶质细胞活化及炎症的影响[目的]星形胶质细胞是大脑中数量最多的细胞,不仅为神经元提供营养和结构支持,还可通过释放各种因子调节周围细胞的存活。本研究通过检测星形胶质细胞的增殖活化和相关神经营养因子及炎症因子的表达,观察HI后亚低温干预对星形胶质细胞活化和炎症反应的影响。[方法]动物模型制备及亚低温干预同“第一部分”。动物分别于HI后0h、12h、1d、2d、3d、7d处死。采用荧光定量PCR检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、星形胶质细胞源营养因子(GDNF)、IL-6和TNF-α的基因表达,免疫组化检测星形胶质细胞的活化和GDNF及IL-6的蛋白表达,免疫荧光双标染色观察星形胶质细胞的凋亡。[结果]与常温组相比,亚低温显著减少海马区星形胶质细胞GFAP的基因表达,及星形胶质细胞的增殖活化和caspase-3依赖的凋亡。亚低温组CDNF的基因没有明显改变,而GDNF蛋白表达明显增加。此外,亚低温显著增加了脑损伤后星形胶质细胞来源相关炎症因子IL-6和TNF-alpha的基因表达,及IL-6的蛋白表达。[结论]HI后亚低温干预可减少星形胶质细胞增殖活化和凋亡,促进神经营养因子GDNF的产生,抑制炎症因子IL-6和TNF-alpha的基因表达。
【作者】熊曼；
【导师】杨毅；
【作者基本信息】复旦大学，儿科学，2013，博士
【关键词】未成熟脑；缺氧缺血；脑损伤；亚低温；神经干细胞；神经元；少突胶质细胞；星形胶质细胞；髓鞘；

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