肺炎支原体外毒素CARDS TX的制备及特性研究

【摘要】背景和目的：最新研究发现肺炎支原体(Mycoplasmapenumoniae,MP)毒力因子–社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(Community-acquiredrespiratorydistresssyndrometoxin,CARDSTX)参与MP侵犯呼吸道等病理生理过程。CARDSTX是由MP基因MPN372编码表达的68KDa蛋白质,主要分布于MP胞膜表面和胞质,具有二磷酸腺苷核糖转移酶(ADP-ribosyltransferase,ART)活性,能造成宿主细胞空泡化,最终导致细胞死亡,参与了MP肺炎等疾病过程。因而被认为是MP的一个重要毒力因子,对其的深入研究可能为MP感染的发病机制提供了一个新的研究方向。本研究拟在体外重组表达并纯化具有活性的CARDSTX,并制备其兔多克隆抗体。为了更好的阐明CARDSTX的特性以及其在MP感染发病机制中的作用,我们进一步研究了CARDSTX在人肺腺癌A549细胞中的定位,对DNA损伤的影响及对人视网膜色素上皮RPE细胞纤毛长度的影响。方法：1.构建带有His-tag的表达载体Pet28b(+)-CARDS,经Ni柱纯化得到单一重组的CARDSTX(rCARDSTX).2.倒置显微镜观察细胞形态学及MTT检测细胞存活率。3.免疫荧光法检测MP或rCARDSTX处理A549细胞后CARDSTX在细胞的分布,及其与MP粘附的关系。4.免疫荧光法检测γH2AX。5.免疫荧光法检测人视网膜色素上皮RPE细胞纤毛的长度。结果：1.采用BamHI和Xhol限制性内切酶双酶切鉴定质粒PET-28b(+)-CARDS,凝胶电泳可见CARDSTX基因片段大小为1773bp。通过考马斯亮蓝染色,纯化的rCARDSTX蛋白清晰可见。2.rCARDSTX处理的细胞生长明显受到抑制,且部分细胞出现了空泡化,50μg/ml处理组细胞空泡化严重并导致细胞死亡,细胞数目减少。MTT试验显示rCARDSTX处理的A549细胞存活率明显下降。3.免疫荧光显示CARDSTX在A549细胞的细胞质和细胞核均有分布,胰酶处理MP后,CARDSTX在细胞内的分布减少。4.rCARDSTX处理A549细胞后细胞核内形成γH2AX焦点。5.MP或rCARDSTX处理RPE细胞后,纤毛长度明显下降。结论：1.成功的构建Pet28(+)-CARDS表达载体,并纯化出具有活性的rCARDSTX.2.在MP或rCARDSTX处理的A549细胞中,CARDSTX在细胞的细胞质和细胞核均有分布,并且与MP的黏附力有关,当MP黏附力下降时,CARDSTX在细胞内的分布减少。3.rCARDSTX和MP均可引起细胞DNA的损伤。4.MP和rCARDSTX均可导致RPE细胞纤毛长度变短。
【作者】李雪静；
【导师】陈志敏；
【作者基本信息】浙江大学，儿科学，2014，硕士
【关键词】肺炎支原体；毒素；粘附；DNA损伤；纤毛；

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