醌氧化还原酶-1的单核苷酸基因多态性与中国人冠心病的关联研究

【摘要】背景冠心病(Coronaryheartdisease,CHD)是严重危害人体健康、影响生活质量的常见病。遗传流行病学研究显示冠心病的发病有遗传因素作用,且与机体内氧自由基(Reactiveoxygenspecies,ROS)的活化和内环境不稳定密切相关。转录因子Nrf2/ARE(NF-E2-relatedfactor2/antioxidantresponseelement)调控多个解毒基因的表达,如过氧化氢酶,过氧化物歧化酶,UDP葡糖醛酸基转移酶,谷氨酰半胱氨酸合成酶,醌氧化还原酶-1(NADP(H):quinineoxidoreductasel,NQO1),谷胱甘肽S-转移酶,谷胱甘肽过氧化物酶-1和血红素氧合酶-1。这些酶中的NQO1为体内一种重要的Ⅱ相反应酶,通过去电子还原反应参与机体内外源物质代谢过程,是苯类物质代谢的关键酶,苯代谢产物苯醌具有强烈的致畸变作用,NQO1可以将其转化为毒性较低的氢醌而清除,是公认的解毒酶和防癌酶。NQO1基因定位于16p22,基因全长20kb,其cDNA609位点上存在着C/T间单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism.SNP)。此位点多态性导致其编码蛋白质上第187位上脯氨酸／丝氨酸(Pro187Ser)的改变,导致其酶活性的减低,NQO1以NADP(H)为受体,可将NADH或NADP(H)的电子传递给醌类,发生双电子还原反应,生成低毒的氢醌类化合物,避免了对细胞的损伤,降低了醌类化合物的致癌危险性。有研究报道NQO1基因突变型蛋白产物在细胞中不稳定,其半衰期只有2小时,而野生型蛋白半衰期为18小时,突变型蛋白通过细胞内蛋白水解酶途径快速降解,而野生型蛋白不受此途径影响,基因的多态性影响NQO1酶的功能。纯合野生型CC具有完全的NQO1酶活性,杂合基因型CT的酶活力较CC明显降低,纯合突变基因型TT的酶活性则完全丧失。因突变的NQO1蛋白会被泛素蛋白酶系统迅速降解掉,携带有纯合子变异的个体检测不到酶活力。由于NQ01基因具有遗传多态现象,而且不同的基因型具有不同的生理功能,近年来,研究NQO1基因多态性与冠心病的发生发展已成为一个新的重要课题。有研究表明NQO1基因型与冠心病的发生密切相关。基于NQO1基因多态性可通过影响机体内外源物质代谢过程,从而可能参与动脉粥样硬化的进程,而且不同的种族和地域NQO1基因多态性可能存在一定的差异,目前国内尚无有关NQO1基因多态性与冠心病相关性研究的报道,因此对中国汉族人该基因多态性和冠心病的探讨是可行的和值得的。目的：本研究通过检测浙江地区中国汉族人NQO1基因多态性频率,以探讨NQO1基因多态性与冠心病发生发展的关系。方法：1研究对象冠心病组：冠心病患者296例,其中男性217例,女性79例,平均年龄62.81±9.80岁。均选自2012年1月至2013年6月心内科住院病人,符合世界卫生组织(WHO)关于缺血性心脏病的命名及诊断标准,所有患者经冠状动脉造影证实其一主要血管存在≥50%狭窄。对照组：对照组286例,其中男性208例,女性78例,平均年龄61.56±10.44岁。选自同期住院病人,所有入选者经心电图,运动平板,心肌酶谱及冠脉造影等一系列检查后排除冠心病诊断。本研究人群均为中国浙江地区汉族人,个体之间无血缘关系。2冠心病的诊断冠状动脉造影时,分别对右冠状动脉、左冠状动脉前降支、左旋支和左主干狭窄病变程度进行评价。各主要分支存在≥50%狭窄定义为有意义病变,诊断为冠心病。3冠心病危险因子调查设计冠状动脉粥样硬化登记调查表,详细记录每一患者的临床表现,辅助检查,化验检查结果,危险因素及冠心病家族史。冠心病经典危险因子按下述标准定义：3.1高血压采用1999年世界卫生组织和国际高血压学会(WHO/ISH)的标准定义和诊断。3.2糖尿病符合1997年美国糖尿病学会(ADA)糖尿病诊断标准。3.3吸烟指目前吸烟和既往吸烟已经戒烟者。4基因组DNA抽提和NQO1基因多态性检测4.1白细胞基因组DNA抽提：以试剂盒法提取外周血白细胞DNA。4.2NQO1基因多态性检测：参考采用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行分析。上海生工引物合成：正义链5’-CCTCTCTGTGCTTTCTGTATCC-3’;反义链5’-GATGGACTYGCCCAAGTGATG-3。反应使用MJPTC200型PCR扩增仪,PCR反应体系TemplateDNAlullOxTagBufferwithKCL2.5ul25mMMgC121.5uldNTPMix,2mMeach2.5ulForwardprimerlulReverseprimerluLThermoTaqDNAPolymerase,5u/ulO.lulDdH2O15.4ulTotalVolume25ul体系25μl含有大约100ng基因组DNA,10pmol每种引物,0.5mmol/LdNTPs,10×PCR缓冲液扩增条件为：在PCR热循环仪上扩增,94℃预变性5分钟,然后94℃变性40秒,63℃退火40秒,72℃延伸1分钟,共进行35个循环,最后在72℃延伸10分钟。取10ulPCR产物在31ul体系中用HINfl内切酶酶切后进行含2%琼脂糖电泳,经70伏特20分钟,在紫外光下观察,摄影并确定结果。NQO1C609T基因野生型产生214bp和84bp2个条带,纯合子变异PCR产物产生149bp、65bp和84bp3个条带,杂合子变异产生214bp、149bp、65bp和84bp4个条带。5统计分析资料输入数据库,应用SPSS18.0软件包作统计学处理。连续变量以均数±标准差(X±s)表示,计数资料以频数和构成比表示。运用Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性。多组均数间比较用方差分析,两组均数间比较用t检验,非正态分布和方差不齐的资料采用非参数统计。检验水准a=0.05,所有结果在P<0.05时视为差异有统计学意义。结果：1研究对象的Hardy-Weinberg平衡中国浙江汉族研究对象符合Hardy-Weinberg平衡,对照组和冠心病组χ2值分别为0.045和0.705,P均>0.05。2研究对象的一般临床资料比较冠心病组与对照组两组间平均年龄,糖尿病,高血压及吸烟比例比较没有显著差异(P>0.05),且两组间舒张压、BMI、TC及TG数值无显著差异(P>0.05)。但冠心病组男性比率较对照组明显增加(P<0.05),收缩压及LDL-C水平明显增加(P<0.05)而HDL-C水平显著降低(P<0.01)。3研究对象的NQO1基因多态性的比较在浙江地区汉族人群冠心病组NQO1-C/C、NQO1-C/T、NQO1-T/T基因型频率分别为30.1%,47.3%,22.6%%。等位基因C与T的频率分布为53.7%%,46.3%。对照组NQO1-C/C、NQO1-C/T、NQO1-T/T基因型频率分别为33.5%,48.2%,18.3%。等位基因C与T的频率分布为57.6%,42.4%。冠心病组与对照组相比无论是NQO1基因型分布还是等位基因的频率均无明显差异(P>0.05)。4冠心病组各基因型间冠心病危险因子的比较NQ01基因型三组间性别比例,糖尿病、高血压及吸烟比例比较没有明显差异(P>0.05),且三组间平均年龄、收缩压、舒张压及BMI数值无明显差异(P>0.05)。但NQO1基因型三组间的TG数值有明显差异(P<0.05),三组间的LDL-C,HDL-C及TC水平比较有显著差异(P<0.01)。进一步行组间的两两比较。具体表现为纯合野生基因型NQO1-C/C组的TG数值比杂合基因型NQO1-C/T组明显升高(P<0.05),纯合突变基因型NQO1-T/T组的HDL-C水平显著高于杂合基因型NQO1-C/T组(P<0.01)。而纯合突变基因型NQO1-T/T组和杂合基因型NQO1-C/T组的LDL-C及TC水平均显著高于纯合野生基因型NQO1-C/C组(P<0.01)。结论：1.浙江地区汉族人群存在NQO1基因多态性,为在我国汉族进行NQO1基因多态性与疾病的关联研究提供了该基因分布的参考数据。2.冠心病组比对照组具有较高的男性比例,较高的收缩压及LDL-C水平,但更低的HDL-C数值。3.浙江地区汉族人群NQO1的C609T单核苷酸基因型与冠心病的发生不相关。4.NQ01的C609T单核苷酸基因型可能影响血脂代谢过程。
【作者】胡鸣颖；
【导师】徐耕；
【作者基本信息】浙江大学，内科学，2014，硕士
【关键词】醌氧化还原酶-1基因；单核苷酸多态性；冠心病；

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