解旋酶Pif1与DNA/RNA复合物的晶体学研究

【摘要】Pifl家族是一种ATP依赖性的核酸解旋酶,包括酿酒酵母中的ScPifl、裂殖酵母中的SpPfhl、小鼠中的mPifl、人类中的hPifl等成员,能够结合和解旋G4结构、单链和双链DNA、DNA-RNA杂合链等核酸底物,在染色体稳定性、端粒代谢、基因的复制、线粒体的功能、基因的转录等方面具有重要的作用和生理功能。为了通过晶体学的方法研究Pif1家族及其复合物的结构,本研究使用大肠杆菌,克隆和表达了鼠源、酵母、人源等4种Pifl的全长或者截短后的蛋白。通过亲和层析和凝胶过滤层析等方法,纯化得到了mPifl1-200，hPifl200-641,SpPfhl305-805,SpPfhl305-790,ScPIFl40-859,ScPIFl40-859-K264A等6个截短后Pif1蛋白,其中hPifl200-641具有较高的纯度,并且稳定均一,适于结晶。通过EMSA和Gelfiltration等方法鉴定了hPifl200-641与不同核酸底物的结合效率,选择出最佳的DNA和RNA底物,纯化得到蛋白与核酸的复合物,进行共结晶。经过优化,得到蛋白hPifl200-641及其复合物的棒状单晶。其中hpifl200-641的蛋白晶体X衍射分辨率较高,可以达到3.5A,属于P321空间群,晶胞参数为：a=b=204.4A,c=77.93A,a=90°,β=90°,y=120°。该研究有助于阐明Pif1结合和解旋DNA和RNA的机制,为接下来的功能学研究奠定了坚实的基础,从而揭示其相关的的生理学功能及分子机理。
【作者】李德望；
【导师】宋海卫；
【作者基本信息】浙江大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】Pif1解旋酶；蛋白质晶体；核酸底物；共结晶；X射线衍射；

【参考文献】
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