RNAi沉默TCAB1表达对肺腺癌A549细胞生物学行为的影响

【摘要】背景和目的：目前,肺癌已是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤,并居恶性肿瘤死亡率的第一位。目前,我们对于肺癌的致病因素和发病机制尚未完全清楚,但近期在端粒酶及其相关蛋白与肿瘤的关系有了较为深入研究。端粒酶是细胞维持端粒长度的最主要途径,许多证据显示端粒的长度和结构的稳定基于端粒酶和端粒末端长度片段在核内的正确定位,并且这种定位的调控受到端粒酶蛋白的影响。Andrew等首次发现端粒酶蛋白关键组分卡扎尔体蛋白1(telomerasecajalbodyprotein1,TCAB1)表达的缺失可在细胞的S期阻止端粒酶复合物运送至端粒末端合成位点,最终导致端粒的形成和维持受到限制。提示TCAB1可能通过调控端粒维持参与恶性肿瘤细胞的增殖。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种由小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)引导的特异性靶向降解mRNA的转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS),其通过RNA干扰起到对靶基因的沉默抑制作用,进而阻止相关致病mRNA和异常蛋白的表达,最终达到调控细胞生长的目的。本研究探讨TCAB1对肺腺癌细胞的生物学影响及其可能的分子机制,为未来以TCAB1靶点治疗肺腺癌的可行性提供实验证据。方法：1.TCAB1siRNA和controlsiRNA(consiRNA)通过Lipofectamine2000转染肺腺癌细胞A549,蛋白质免疫印迹技术和半定量PCR检测转染48hTCAB1蛋白和mRNA的表达水平。2.用免疫荧光技术检测稳定转染TCAB1siRNA至A549后端粒酶结合到端粒的情况,Southernblot实验检测A549细胞端粒长度的变化。3.MTT法检测转染TCAB1siRNA的A549细胞生长及增殖能力,以转染consiRNA和未处理的阴性A549细胞做为对照组。4.流式细胞术检测稳定转染A549细胞的细胞周期和凋亡的变化情况。半定量PCR检测周期蛋白依赖性激酶CDK6的表达。结果：1.TCAB1在肺腺癌细胞A549中有稳定的表达。转染TCAB1siRNA的A549细胞与转染consiRNA的A549细胞相比,TCAB1蛋白的表达量显著下降,抑制率(74.5±8.1)%,P<0.05。TCAB1mRNA表达也受到明显抑制,抑制率为为(67.9±3.23)%,P<0.05。2.与对照组A549-ConsiRNA细胞和阴性对照组A549细胞比较,A549-TCAB1siRNA细胞中端粒酶标记蛋白(hTERT)与端粒标记蛋白(TRF-2)的结合减少,相同面积大小随机视野内结合概率减少(60±6.9)%,P<0.05。但TCAB1siRNA转染的细胞与对照组比较(三次试验测得平均值),端粒长度没有明显变化。3.A549-TCAB1siRNA细胞较对照组A549-ConsiRNA细胞和阴性对照组A549细胞存活率降低。A549-TCAB1siRNA组比A549-consiRNA组细胞在24h内存活率降低了(23.9±5.9)%,48h内存活率降低了(20.7±5.8)%,72h内存活率降低了(30.8±2.4)%,差异有统计学意义(P<0.05)。4.A549-TCAB1siRNA组细胞与对照组A549-ConsiRNA细胞比较,处于G1期的细胞比率比对照组(三次试验平均值比较)增加了(13.0±2.3)%,处于S期的细胞比率比对照组减少了(12.8±0.5)%.A549-TCAB1siRNA细胞与对照组A549-ConsiRNA细胞比较CDK6蛋白表达减少了(58.0±9.9)%,且具有统计学意义,P<0.05。5.结论：1.TCAB1siRNA转染肺腺癌细胞A549显著抑制TCAB1mRNA和蛋白质的表达。2.沉默TCAB1的表达抑制A549细胞中端粒酶与端粒的结合,下调周期蛋白依赖性激酶CDK6的表达,诱导细胞G1/S阻滞,进而抑制A549细胞的增殖。
【作者】袁平；
【导师】胡坚；
【作者基本信息】浙江大学，外科学，2014，硕士
【关键词】肺腺癌；RNA干扰；卡扎尔体蛋白1；端粒；端粒酶；细胞周期；

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