CD9基因影响硼替佐米抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的研究

【摘要】多发性骨髓瘤(Multiplemyeloma,MM)是最为常见的血液系统恶性肿瘤之一,发生率占血液系统恶性肿瘤的10%左右。随着我国人口老龄化趋势日益加剧,该病的发生率在我国呈逐年增高的趋势。蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)能够通过细胞凋亡抑制MM细胞生长,在MM的治疗中显示出了较好的疗效。然而,随着其临床应用范围的扩大和时间的推移,国内外临床研究已发现,部分MM患者对硼替佐米产生了耐药反应,或在初期治疗有效的MM患者中出现耐药及疾病的复发,从而影响了硼替佐米的疗效。因此,揭示MM对硼替佐米的可能的耐药机制将具有非常重要的临床意义。我们在前期比较了对硼替佐米有效的骨髓瘤病人和对硼替佐米无效的骨髓瘤病人,基因芯片分析发现,CD9基因在对硼替佐米无效的的病人中下降的最明显。为了进一步深入探讨CD9在硼替佐米治疗多发性骨髓瘤中可能发挥的作用,我们进行了本课题的研究。本研究将分析MM细胞株中CD9基因表达情况与基因启动子甲基化的相关性；通过分子生物学技术进一步阐明了CD9影响硼替佐米抑制骨髓瘤细胞增殖及相关机制的研究。方法采用半定量RT-PCR检测9种不同的MM细胞株CD9mRNA的表达水平；甲基化特异PCR(MSP)及亚硫酸氢盐-基因组测序法(BGS)检测不同MM细胞株启动子甲基化情况对不同MM细胞株进行了5-Aza-DC去甲基化处理,RT-PCR检测药物处理前后CD9基因mRNA表达情况；用IC50浓度检测不同CD9表达的MM细胞株对硼替佐米的药物敏感性；分别用去甲基化药物5-Aza-DC和硼替佐米以及两者联合作用于MM细胞株,MTS检测MM细胞株增殖的影响；通过慢病毒转染,获得稳定表达CD9的MM细胞株,硼替佐米作用于稳定转染CD9的MM细胞株,MTS、流式细胞术检测药物对MM细胞增殖及凋亡的影响；最后采用基因芯片技术初步探讨CD9影响硼替佐米对MM细胞增殖作用的机制。结果在9种不同的MM细胞株中的CD9表达水平高低不一,其中ARK、MM.1S.RPMI8226和OPM2细胞呈高表达,CAG细胞呈低表达,而U266、ARP-1、NCI-H929和DAN细胞几乎不表达；在低表达或沉默表达的2个骨髓瘤细胞株(H929和U266)中,经启动子去甲基化药物(5-aza-DC)处理后CD9基因的mRNA表达水平恢复或增强；MSP检测发现CD9基因启动子在5个低表达CD9的骨髓瘤细胞株(U266、ARP-1、H929、CAG、DAN)中出现全部甲基化或部分高甲基化。BGS测序结果与MSP检测基本相一致；CD9低表达或沉默表达的2个骨髓瘤细胞株U266和H929对硼替佐米的IC50分别为20.9nM和18.5nM,CD9高表达的2个骨髓瘤细胞株8226和MM.1S对硼替佐米的IC50分别为5nM,6.2nM;分别用(5-aza-DC)和硼替佐米或者两者联合作用于骨髓瘤细胞株U266和H929,MTS结果显示硼替佐米组和联合用药组相比于对照组能够明显抑制MM细胞的增殖(p<0.05),且联合用药组对MM细胞增殖抑制的作用明显优于硼替佐米组(p<0.05)；硼替佐米作用于稳定转染CD9基因的MM细胞株U266,发现与空载组相比硼替佐米能明显抑制MM细胞的增殖(p<0.05),促进其凋亡(p<0.05)。利用基因表达谱芯片技术检测包括人类肿瘤发生相关的多功能基因的变化情况,共发现298个表达差异明显的基因,其中上调基因有113个,下调基因有185个。结合Pathway分析发现CD9明显上调了3条信号通路,明显下调了5条信号通路。结论CD9是一个受表观遗传学调控的基因,其在多发性骨髓瘤中的表达下调与基因启动子DNA甲基化密切相关；去甲基化药物(5-aza-DC)与硼替佐米对骨髓瘤细胞的增殖具有协同抑制作用,其机制可能是(5-aza-DC)恢复了骨髓瘤细胞中CD9的表达,进一步的研究发现CD9可能是通过影响内质网蛋白折叠信号通路和NK-κB信号通路来影响硼替佐米对骨髓瘤细胞增殖的抑制作用。
【作者】宣涵；
【导师】黄金文；
【作者基本信息】浙江大学，血液病学，2014，硕士
【关键词】CD9；MM；启动子甲基化；

【参考文献】
[1]冉文学.单元物料订单分拣轮询控制系统研究[D].云南大学,2014.
[2]李树君,方宪法,南国良,张小超.数字农业工程技术体系及其发展[J].农业机械学报.2003(05)
[3]戴文鹏.论突发事件应对中行政应急权力的法律规制[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[4]李婷婷.天然有机质与纳米碳管相互作用机制及影响因素[D].浙江大学,环境科学,2012,硕士.
[5]方云飞,王宏琳.电子计算机数据处理入门[J].石油地球物理勘探,1980,S1:95-101.
[6]郑周明.一个文学生产机制时代的微景[D].上海大学,文艺学,2013,硕士.
[7]张优.旅游度假区居住建筑设计研究[D].河北工程大学,建筑技术科学,2012,硕士.
[8]徐杰峰.基于.NET的XProc处理系统的设计与实现[D].华中科技大学,软件工程,2013,硕士.
[9]王再兴,尚平.模具电火花—机械复合加工中心的开发[J].机电一体化.1996(03)
[10]王歌.山东省农产品国际竞争力研究[D].吉林大学,国际贸易学,2014,硕士.
[11]赵敏.分析型客户关系管理系统分析与设计[D].武汉理工大学,2005.
[12]孙冬梅.哈尔滨站行包仓储系统绩效管理改进研究[D].吉林大学,工业工程,2014,硕士.
[13]田萤.PPP模式下准经营性基础设施项目的风险分担研究[D].重庆大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[14]陈巧敏,张晓辛.加入WTO后我国农机化的发展对策[J].中国农机化.2002(02)
[15]杨美琳.草酸二乙酯加氢Cu/SiO_2催化剂的研究[D].天津大学,化学工艺,2013,硕士.
[16]张朝威.Al-12.7Si-0.7Mg合金MIG焊接接头组织与性能的研究[D].东北大学,材料学,2010,硕士.
[17]陈英武,邢立宁,王晖,葛斌,李沛,赵青松.网络环境下社会管理的组织行为建模与计算实验研究综述[J].自动化学报,2015,03:462-474.
[18]尹福利.齿轮四杆组合机构参数化设计方法的研究[D].湖南大学,机械工程,2011,硕士.
[19]王北辰.基于结构化索引的RDF数据存储及查询方法的研究与实现[D].北京交通大学,2013.
[20]张狂静.抗战时期毛泽东的文化思想研究[D].长春工业大学,思想政治教育,2013,硕士.
[21]米增强,苏勋文,余洋,王毅,吴涛.双馈机组风电场动态等效模型研究[J].电力系统自动化,2010,17:72-77.
[22]廖军.基于MMPI的多核系统任务迁移算法设计与实现[D].哈尔滨工业大学,微电子学与固体电子学,2014,硕士.
[23]王正富.污泥水富集硝化菌强化城市污水处理系统生物硝化研究[D].西安建筑科技大学,环境工程,2013,硕士.
[24]郭小雪.淘宝网客户关系管理应用研究[D].北京交通大学,2012.
[25]招阳.考虑墩体参振的高速磁浮交通轨道梁动力特性研究[D].北京交通大学,2009.
[26]朱远明.基于参数化控制器的数据驱动控制方法研究[D].北京交通大学,交通信息工程及控制,2014,博士.
[27]乐全明,董志赟,郑华珍,郁惟镛,张沛超,王忠民,章启明.基于时态逻辑技术的高压输电线系统故障诊断[J].电力系统自动化,2006,09:38-43.
[28]秦梅.高分子共混体系热力学相行为的研究[D].哈尔滨理工大学,材料物理与化学,2003,硕士.
[29]薛付春.菖蒲郁金汤对多发性抽动症模型小鼠脑组织中单胺类神经递质含量的影响[D].甘肃中医学院,中医儿科学,2014,硕士.
[30]梁世传.说“山水画临摹”[D].河北师范大学,美术学,2013,硕士.
[31]龚小勇.XML Web Service技术在职教管理系统开发中的应用研究[D].重庆大学,计算机技术,2003,硕士.
[32]薛兴昌,贺宝童,刘炳南,方国才,陈尚恒.不减产技术改造项目的组织和实施[J].冶金自动化,2001,03:42-45.
[33]孙阔.《宪政》月刊研究[D].首都师范大学,中国近现代史,2014,硕士.
[34]毕建玲.我国住宅产业化研究[D].重庆大学,技术经济及管理,2003,硕士.
[35]宋范范1,张康逸1,,张薇薇2,何梦影1.无水乙醇萃取联合氧化铝柱层析制备高纯磷脂酰胆碱[J].食品科学.
[36]汪建仙.车牌自动识别技术及应用[D].浙江工业大学,2012.
[37]柳霖坡.结球甘蓝三倍体的创建及其细胞和胚胎发育研究[D].河北农业大学,蔬菜学,2004,硕士.
[38]周浩.辽宁乒乓球队后备人才类型打法现状分析及培养对策研究[D].沈阳体育学院,体育教育训练学,2013,硕士.
[39]王怀涛.Mn、Ti对热浸镀锌铝合金及其镀层组织、耐蚀性的影响[D].南京航空航天大学,材料学,2013,硕士.
[40]刘瑞林.伊拉克外交政策中的认同因素探析[D].山西师范大学,世界史,2014,硕士.
[41]陈瑞勤.北冰洋放线菌FADH2-依赖型卤化酶基因的筛选、克隆与异源表达[D].华东理工大学,海洋生物学,2014,硕士.
[42]张颍.HD公司原材料仓储管理外包效益与风险分析[D].北京交通大学,2014.
[43]贺海燕.多元智能理论在初中英语教学中的应用[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[44]高磊.互联网环境下的电子支付[D].对外经济贸易大学,2005.
[45]王珊珊.中型软件企业学习型组织构建对企业绩效影响的实证研究[D].江苏科技大学,企业管理,2014,硕士.
[46]程琛.学前教育专业作文教学的问题及对策研究[D].鲁东大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[47]朱安妮.垂盆草对四氯化碳致小鼠急性肝损伤保护作用的研究[D].北京中医药大学,中西医结合基础,2014,硕士.
[48]张芙蓉.76例多发性骨髓瘤临床特征及疗效分析[D].山西医科大学,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[49]苏颖.新时期至新世纪关于“三年灾荒”的文学书写[D].安徽大学,现当代文学,2013,硕士.
[50]房传峰.计算机类物资管理信息系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.