溶瘤病毒ZD55-TRAIL对多发性骨髓瘤细胞株的杀伤及联合作用机制的研究

【摘要】第一部分：ZD55-TRAIL对多发性骨髓瘤(MM)细胞株的生长抑制及诱导凋亡作用目的：研究ZD55-TRAIL对MM细胞株的生长抑制及诱导凋亡情况,从而为进一步研究ZD55-TRAIL的抗骨髓瘤凋亡机制打下基础。方法：MTT法检测ZD55-TRAIL对骨髓瘤细胞株的生长抑制作用,流式细胞术分析ZD55-TRAIL对骨髓瘤细胞株的感染率,Hoechst染色法观察ZD55-TRAIL诱导MM细胞凋亡的形态学改变,Western-blot法检测ZD55-TRAIL作用后Caspase-3.Caspase-8、Caspase-9和PARP蛋白的表达变化,Western-blot法检测IGF-1R及其下游NF-KB靶蛋白表达变化。结果：(1)0～40MOI的ZD55-TRAIL分别作用于RPMI8226、MM1S、MM1R细胞株24小时之后,IC50约3-78MOI,0-20MOI的ZD55-TRAIL分别作用于RPMI8226、MM1.S、MM1.R细胞株48小时之后,IC50约2～6.4MOI。表明骨髓瘤细胞株包括DXM-敏感和DXM-耐药的细胞株对ZD55-TRAIL均敏感。(2)0～50MOI的ZD55-TRAIL分别作用于RPMI8226细胞株24h和48h后,在荧光显微镜下观察GFP表达呈时间和剂量依赖性增加,流式细胞术检测5MOI、25MOI、50MOI时的GFP表达率分别为16.8%、52.8%和62.9%。(3)分别以0～10MOI的ZD55和ZD55-TRAIL作用于RPMI8226细胞株48小时后,MTT检测细胞活性,发现ZD55-TRAIL具有更强的细胞毒性,而ZD55细胞毒力较小。(4)外源性IL-6(10ng/ml)不能逆转ZD55-TRAIL诱导的RPMI8226凋亡,提示ZD55-TRAIL可以抑制细胞因子诱导的细胞生长。(5)以16MOI的ZD55-TRAIL作用于RPMI8226细胞株24h后,与对照组相比细胞核内可见明显的凋亡小体,从形态学上证明ZD55-TRAIL可以诱导MM细胞发生凋亡。(6)ZD55-TRAIL诱导RPMI8226细胞株凋亡时,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和PARP激活,Bcl-xl下调。TRAIL蛋白表达呈剂量依赖性增加,其死亡受体DR4、DR5无明显变化。(7)ZD55-TRAIL能够下调IGF-1R(mRNA和蛋白水平)及其下游NF-KB靶蛋白,但对P110a、P110δ影响不大。(8)外源性IGF-1不能够逆转ZD55-TRAIL对MM细胞的杀伤作用和蛋白抑制作用。第二部分：溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL协同PI3K抑制剂LY294002或蛋白酶体抑制剂MG132诱导MM细胞株死亡及机制研究目的：研究溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL协同LY294002或MG132促进MM细胞的凋亡作用,并探讨协同促凋亡的机制。方法：通过MTT法检测ZD55-TRAIL联合PI3K抑制剂或蛋白酶体抑制剂对MM细胞株和正常肝脏细胞株LO2的生长抑制作用,Western-blot法检测Caspase-3、PARP,PI3K/Akt/mTOR通路的相关蛋白表达情况,集落形成实验观察细胞克隆情况,结晶紫染色观察对正常肝脏细胞株LO2的的杀伤作用,Hoechst染色法观察联合处理对RPMI8226细胞株诱导凋亡后的形态学变化。结果：(1)MTT结果显示溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL与PI3K抑制剂LY294002具有协同抑制MM的作用。(2)Western-blot结果显示单独溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL处理RPMI8226细胞株后,出现Akt/mTOR通路蛋白的激活。但PI3K抑制剂LY294002联合后能够增强ZD55-TRAIL诱导细胞凋亡,caspase-3、PARP蛋白激活明显,且对Akt/mTOR通路相关蛋白的靶向抑制作用更明显。(3)蛋白酶体抑制剂MG132与溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL,MTT结果显示有较好的协同作用,CI<1。并对正常肝脏细胞株L02无抑制。(4)Western-blot显示较低剂量的MG132和ZD55-TRAIL联合即可引起凋亡明显增强,Caspase3、Caspase8、Caspase9和PARP激活,TRAIL的死亡受体DR5增强明显,而DR4激活不明显。单独浓度梯度的MG132也可引起DR5上调而DR4表达不变。(5)集落培养进一步证实ZD55-TRAIL与MG132具有协同抗MM作用。(6)结晶紫染色证实MG132和ZD55-TRAIL的联合处理对L02细胞株无杀伤作用。结论：骨髓瘤细胞株包括DXM-敏感和DXM-耐药的细胞株对溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL敏感,可诱导凋亡,并抑制IGF-1R和下游的NF-κB靶蛋白。ZD55-TRAIL与LY294002联合可克服病毒本身引起的Akt/mTOR的激活,促进细胞凋亡。另外,死亡受体DR5的上调可能是ZD55-TRAIL与MG132协同诱导凋亡的机制之一。这些发现为以后以TRAIL为基础的腺病毒治疗与PI3K抑制剂或蛋白酶体抑制剂的临床联合使用提供依据。
【作者】朱维维；
【导师】钱文斌；童茵；
【作者基本信息】浙江大学，内科学，2014，硕士
【关键词】多发性骨髓瘤；Oncolysis；TRAIL；IGF-1R；mTOR；AKT；凋亡；

【参考文献】
[1]张洪帅.TDDM-BOC调制信号检测技术研究[D].沈阳理工大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[2]杨永利.黑龙江省农村公共产品供给问题研究[D].吉林大学,农业推广,2012,硕士.
[3]姚亚龙.新疆高等院校油画教学与人才培养模式研究[D].新疆师范大学,美术学,2013,硕士.
[4]任泓宇.近红外静脉图像特征增强及可视化算法[D].中国矿业大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[5]李葆华.论民族主义与社会主义的关系[D].中共中央党校,科学社会主义,2004,硕士.
[6]肖亚运.一线新员工企业融入中的小组工作介入[D].苏州大学,社会工作（专业学位）,2014,硕士.
[7]董华强.风力发电机组的振动状态监测与故障诊断技术研究[D].兰州理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[8]王赛一,王成山.配电网中辐射线路的最优分段处理[J].电力系统自动化,2005,08:50-54.
[9]郭建涛.计算全息和光学图像的随机相位加密技术研究[D].大连理工大学,信号与信息处理,2004,硕士.
[10]董丽佳,桑卫国.模拟增温和降水变化对北京东灵山辽东栎种子出苗和幼苗生长的影响[J].植物生态学报,2012,08:819-830.
[11]时翔.基于压缩感知的加密图像编解码方法[D].中南民族大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[12]郑哲.我国商业银行盈利能力与存贷利差关系的实证分析[D].江西财经大学,国民经济学,2013,硕士.
[13]樊恒希.江西省基本公共服务均等化问题研究[D].江西财经大学,行政管理,2013,硕士.
[14]李键.变流器数据采集系统的设计与实现[D].天津理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[15]吴昊.输电线路杆塔接地系统冲击散流特性及影响因素研究[D].西南交通大学,高电压与绝缘技术,2014,硕士.
[16]杨捷.《黄河大合唱》与清唱剧《长恨歌》之比较研究[D].河北大学,艺术学,2002,硕士.
[17]周宁.清末民初的互助进化思想[D].安徽大学,专门史,2004,硕士.
[18]何敬业.复杂系统可靠度最优配置[J].自动化学报,1985,03:325-330.
[19]张阳.基于融资约束的中国上市公司现金持有价值研究[D].安徽大学,工商管理,2014,硕士.
[20]鲍巧红.咪唑并邻菲咯啉类衍生物及其配位聚合物的合成、结构与性质研究[D].西北大学,物理化学,2013,硕士.
[21]韩晓.释意理论视角下的“两会”新闻发布会口译[D].山东师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[22]张燕.宁马地区构造岩浆活动与成矿的关系[D].中国地质科学院,构造地质学,2013,硕士.
[23]叶丽娟.GZG集团“三旧改造”项目营销定位研究[D].广东工业大学,企业管理,2014,硕士.
[24]李荣宾.芹菜素对人肺癌细胞株A549迁移和侵袭能力的抑制作用及机制[D].福建医科大学,外科学,2014,硕士.
[25]息嘉慧.病态美-“80后”女性画家的绘画语境[D].首都师范大学,美术,2014,硕士.
[26]伍文通.印刷设计在热贡唐卡的现代推广与传播中的应用研究[D].西南交通大学,设计艺术学,2014,硕士.
[27]徐伟民.国产TRT推广应用中应注意的几个问题[J].炼铁.1998(01)
[28]陈琦.锡林郭勒草原煤矿排土场植被恢复措施应用效果初步评价[D].内蒙古农业大学,农业资源利用,2013,硕士.
[29]胡霞.先前知识、社会网络对创业机会识别的影响：警觉性的中介作用[D].西南交通大学,企业管理,2014,硕士.
[30]邓勇.电信企业人力资源开发战略研究[D].湖南大学,2004.
[31]孙博凯.基于短时谱估计的语音增强算法研究与优化[D].哈尔滨理工大学,信号与信息处理,2012,硕士.
[32]曹桂斌.高速线阵CCD扫描图像采集与存储系统的设计[D].南京理工大学,光学工程,2013,硕士.
[33]田婷.培养高中生英语学习兴趣的策略研究[D].华中师范大学,教育管理,2014,硕士.
[34]苏婉昀.太阳能跨季节贮热—地源热泵热水系统在住宅中的应用研究[D].长安大学,市政工程,2014,硕士.
[35]陈长益,吴华珠.我国石墨烯领域专利信息可视化分析[J].现代情报,2014,03:120-124.
[36]胡楷.社会技术系统理论及其在项目组织设计中的应用[D].武汉理工大学,企业管理,2003,硕士.
[37]刘晔.我国私人银行组织模式选择研究[D].河北大学,金融学,2014,硕士.
[38]范莉萍.百令胶囊对桥本氏甲减免疫功能及甲状腺功能的影响[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[39]王晓玲.戒毒人员社会支持对应付策略的影响[D].华中师范大学,心理健康教育,2014,硕士.
[40]肖玲.基于智能终端的养殖场监管平台设计与实现[D].中南林业科技大学,农业信息化,2014,硕士.
[41]张巍.高速汽油发动机性能优化的模拟计算及试验研究[D].天津大学,动力工程,2013,硕士.
[42]盛兆俊.电力市场条件下无功综合优化的研究[D].华北电力大学（河北）,电力系统及其自动化,2004,硕士.
[43]行登恺,张彦魁.应用网络计划技术实现最佳设计周期[J].油田地面工程.1990(03)
[44]张元奇,徐绍堂.平面四连杆机构等效转动惯量计算公式和应用[J].一重技术.2006(03)
[45]李开志.竹材热解多联产产物特性的实验研究[D].华中科技大学,热能工程,2013,硕士.
[46]黄晓敏.阴影衰落环境下无线多跳网络链路传输特性研究[D].哈尔滨工业大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[47]王利卿.报社应用软件研发工作的特点[J].中国传媒科技.2003(11)
[48]薛莎莎.模块化思想在现代住宅设计中的运用[D].北京建筑大学,建筑学,2013,硕士.
[49]胡飞,段玲,丁建文.锯齿型石墨纳米带叠层复合结的电子输运[J].物理学报,2012,07:416-421.
[50]杨英华,吴英华,陈晓波,秦树凯.基于独立源分析的过程监测方法[J].控制与决策,2006,10:1190-1192+1196.