程序性细胞坏死调控的TNF-α诱导的神经毒性独立于ROS和钙离子通道

【摘要】
【作者】王兴；
【导师】何苏丹；
【作者基本信息】苏州大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【研究背景和意义】肿瘤坏死因子(TNF-)在调节神经炎症方面是一个重要的促炎症因子。在各种神经退行性疾病中，例如阿尔茨海默病（即老年痴呆症）和帕金森氏病中可以看到TNF-的上调。然而，TNF-诱导的神经毒性这条信号通路仍然不清楚。
【研究目的】确定RIP3介导的程序性细胞坏死（又称necroptosis）是否参与TNF-和TRAIL诱导的神经细胞毒性。
【研究方法】野生型小鼠和RIP3缺陷型小鼠分别注射PBS和不同浓度肿瘤坏死因子（TNF-）,通过小鼠大脑组织切片染色观察小鼠大脑海马区细胞损伤情况以及检测TNF-刺激后海马组织中细胞坏死关键调控蛋白的表达情况；利用普遍用于研究的海马神经元细胞系HT-22深入研究TNF-诱导的细胞死亡机制,首先检测HT-22细胞对TNF-诱导的细胞凋亡（常规诱导体系为TNF-或者TNF-Smacmimetic）和TNF-诱导的细胞坏死(常规诱导体系为TNF-/z-VAD）的敏感性，同时也检测了细胞对TNF家族的另一重要因子TRAIL诱导的细胞凋亡和坏死的敏感性；应用RNA干扰技术分别沉默程序性细胞坏死通路中的相关蛋白，检测蛋白沉默后对TNF-/z-VAD或TRAIL/z-VAD诱导的神经毒性的影响；应用蛋白免疫印迹方法检测沉默后关键蛋白的表达情况；应用慢病毒感染的方法构建稳定表达野生型RIP3(WT)，激酶突变的RIP3(RIP3-K51A)和RIP同源相互作用域突变的RIP3(RIP3-RHIMMut)的HT-22的细胞系检测关键蛋白RIP3在TNF-/z-VAD或TRAIL/z-VAD诱导的细胞坏死中的作用；利用特异性化学抑制剂分别干预ROS以及钙离子通道，从而检测这些步骤是否参与TNF-诱导的HT-22细胞坏死。
【研究结果】（1）小鼠脑室内注射TNF-后，发现在野生型小鼠海马区细胞出现损伤，而且呈现剂量依赖性，但在RIP3缺陷的小鼠中并没有出现明显的海马细胞损伤；应用蛋白免疫印迹发现注射TNF-的野生型小鼠海马组织中RIP3和RIP1蛋白表达呈现明显上调。这些结果表明RIP3-依赖性细胞坏死参与TNF-诱导小鼠海马神经细胞毒性。（2）我们选择了小鼠海马神经细胞HT-22用于深入研究TNF-诱导的海马神经毒性的分子机制。我们发现HT-22细胞对常规的TNF-诱导的细胞凋亡体系不敏感，只有在凋亡抑制剂z-VAD的存在下才对TNF-表现出敏感性，同时还发现只在z-VAD的存在下细胞对TRAIL也表现出敏感性下提示这些表明HT-22细胞更倾向于发生TNF-以及TRAIL诱导的细胞坏死而不是凋亡。（3）通过RNAi干扰技术，沉默RIP3蛋白的表达，发现RIP3的缺陷能抑制TNF-/z-VAD和TRAIL/z-VAD诱导的海马神经细胞死亡，这说明TNF-/z-VAD和TRAIL/z-VAD诱导的细胞死亡是RIP3介导的程序性细胞坏死。（4）进一步沉默RIP1或者CYLD（RIP1的去泛素化酶）,同样能够抑制这种细胞死亡，也说明这种细胞坏死依赖于RIP1和CYLD。（5）接着我们又沉默了RIP3下游蛋白MLKL,该蛋白也是TNF-/z-VAD和TRAIL/z-VAD诱导的细胞死亡。以上结果说明了TNF-诱导的海马细胞坏死是由CYLD-RIP1-RIP3-MLKL信号通路所介导发生的。（6）ROS以及钙离子通道被报道在一些细胞株中参与TNF-α诱导的细胞坏死，我们利用了两种ROS抑制剂（BHA和NAC）以及钙离子抑制剂（LaCl3）干预这些步骤，发现这些抑制剂并不能有效阻止TNF-诱导的HT-22细胞坏死，表明TNF-诱导的海马神经细胞坏死不依赖于ROS以及钙离子通道。
【结论】综上所述，这些结果不仅首次提供了RIP3在体内参与TNF-诱导的海马神经细胞毒性的证据，并且揭示了TNF-可诱导海马神经细胞发生CYLD-RIP1-RIP3-MLKL介导的细胞坏死，而且其下游信号不依赖于ROS和钙离子通道。
【关键词】细胞坏死；TNF-α；海马神经元；RIP3；ROS；钙离子通道；神经毒性；

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