利用APE-PCR方法筛选白血病原病毒插入位点及相关基因的研究

【摘要】白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，它的发病机制至今尚未明确，影响其发病的因素有很多，病毒是影响因素之一。目前一般认为，前病毒插入性诱变激活原癌基因可以产生白血病。于是寻找原病毒的插入位点，检测白血病相关的遗传学变异并发现相关的基因就具有重要的意义。另外，插入诱变对于在肿瘤生成中探索重要的生物学遗传调节和传导途径是一种有用的策略，而这一策略的成功实施主要依赖于一种有效的方法来鉴定基因组中的插入位点。目的：本文旨在研究出一种新的高效简便地用于筛选白血病的原病毒插入位点和其他类型DNA元件插入位点的PCR方法；寻找在急性髓细胞白血病（AML）发生和产生耐药过程中原病毒的共同插入位点，发现相关基因。方法：通过对原有PCR方法在酶切组合、连接效率、纯化方法等方面进行改进得到一种用于克隆基因组DNA插入位点的PCR方法—末端腺苷引物延伸聚合酶链式反应（APE-PCR）；同时构建一种运用阿糖胞苷（Ara-C）治疗的AML小鼠模型，利用APE-PCR方法对该模型中收集到的原发性肿瘤样本进行原病毒插入位点鉴定；最后利用高通量测序法分析和寻找共同插入序列和相关基因。结果：我们已经证实APE-PCR方法可以扩增出更多更长的原病毒插入位点相关片段，产生较低的非特异性背景，需要更少的步骤和更少的DNA样本量，还可以灵活地选择限制性内切酶，且花费更低的成本。在这个方法中利用纳米级的磁珠替代常规磁珠可以提高其效率，而且使用少量的DNA也可以回收和分析原病毒插入位点（PIS）。另外，已经初步筛选得到部分与白血病发生可能相关的基因，但还需要进行进一步的验证。结论：APE-PCR在描绘原病毒插入位点上是一种有效的方法，而且可能也适用于筛选其他类型DNA元件的插入位点。本实验中已经初步筛选得到一些与白血病发生可能相关的基因，为白血病的发生及相关的功能基因组学研究提供了一种可靠的依据。
【作者】徐中娟；
【导师】尹斌；
【作者基本信息】苏州大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】鼠白血病病毒；插入诱变；聚合酶链式反应；共同插入位点；

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