露水草HMGR基因的克隆分析及20-羟基蜕皮甾酮生物合成调控研究

【摘要】20-羟基蜕皮甾酮（20-hydroxyecdysterone，20E）是露水草（CyanotisarachnoideaC.B.Clarke）植株中的主要甾酮活性成分，它不仅被广泛应用于蚕桑业，而且具有许多药理活性，能够有效促进哺乳动物多种组织和器官的核酸与蛋白质的合成，促进糖代谢和脂类代谢，改善高血糖症和高血脂症，调节免疫功能和中枢神经系统，改善和治疗缺氧和缺血性脑损伤，因此受到了世界各地科学研究工作者的广泛重视。然而，由于其结构复杂，化学合成不能用于商品生产，其天然来源匮乏问题始终制约着该化合物在农业、医药业上的应用。20E属于植物甾酮类化合物，3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase，HMGR）被认为是甾酮合成中的关键限速酶，是细胞中类异戊二烯生物合成途径中的关键调控点，所以研究HMGR对了解植物甾酮的生物合成及其调控具有重要的理论意义。我们首先从露水草植株中克隆出露水草HMGR基因（CaHMGR），其基因全长为2037bp，由91bp的5，非翻译区（untranslatedregion，UTR）、1800bp的开放阅读框（openreadingframe，ORF）以及146bp的3，非翻译区组成。开放阅读框编码一条含有599个氨基酸的多肽，预测其等电点和分子量分别为7.25与64.0kDa。在NCBI数据库上对CaHMGR进行检索比对，我们发现CaHMGR与已报道的许多其他植物的HMGR的氨基酸序列十分相似。对推导出的多肽序列进行生物信息学分析，发现其含有两个3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）的结合域（ELPIGFVQLP和TTEGCLVA）和两个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）的结合域（DAMGMNM和GTVGGGT）。通过利用Swiss-Modeling对CaHMGR进行基于同源性的三级结构模型分析，结果表明CaHMGR蛋白具有错综复杂的空间结构，其催化结构域包括L-结构域、N-结构域和S-结构域，与其他植物的HMGR的结构域十分相似。这暗示CaHMGR与其他植物的HMGR存在一定的催化相似性，而且CaHMGR是一个有功能的还原酶。根据CaHMGR及其他植物、真菌、昆虫及动物的HMGR构建系统发生树，结果表明HMGR都来自于一个共同的祖先并且逐渐进化成四个分支，其中CaHMGR属于植物HMGR这一分支，与阳春砂HMGR的亲缘关系最为接近。这些都说明CaHMGR属于植物HMGR超家族。我们建立了CaHMGR的绝对荧光实时定量PCR的检测方法，并调查了茉莉酸甲酯（methyljasmonate,MeJA）对CaHMGR表达模式的影响。我们设计了基因特异性引物CaHF和CaHR，荧光实时定量PCR的熔解曲线只有单个峰，特异性产物熔解曲线峰Tm为82.5℃，表明引物特异性良好。同时，我们将质粒标准品10倍梯度稀释成不同浓度为模板进行反应，根据获得的Ct值及基因拷贝数拟合曲线，得到标准曲线方程为y=-3.1116x+37.05，曲线拟合度R2达到0.9974，说明曲线线性关系良好，可用于准确的定量。计算获得的荧光实时定量PCR的扩增效率为102.6%，同样符合荧光实时定量PCR的要求。CaHMGR在根、茎及叶中都有表达，在各组织表达的情况各异，其中在茎中表达最高，其次为根，再次为叶。MeJA对CaHMGR有明显的诱导上调作用。MeJA处理组根和叶中HMGR的表达为对照组的两倍左右，而茎中HMGR的表达与对照组相比没有显著性差异。以上结果表明，CaHMGR是一个诱导响应型基因，可被诱导子如MeJA有效诱导。采用MeJA、酵母诱导子（yeastelicitor,YE）及硝酸银（AgNO3）三种诱导子刺激露水草悬浮细胞培养体系，当施加0.2mMMeJA处理悬浮细胞时，测得细胞中20E含量为80.95μg/gDW，为对照组的8倍，而AgNO3（25μM）处理组的含量为对照组的6倍，YE（100mg/L）处理组的为对照组的2倍，说明这三种诱导子均能明显提高悬浮细胞中的20E的含量，为采用大规模生物反应器生产20E提供基础研究。采用之前建立的荧光实时定量PCR方法检测露水草悬浮细胞中HMGR的表达水平，结果表明三种诱导子均能明显提高CaHMGR的表达水平。我们的结果显示CaHMGR可被诱导子诱导高表达从而更多的甲羟戊酸可被合成进入类异戊二烯生物合成途径用以合成萜类或植物甾体化合物。在本文中，我们首次从露水草中克隆出HMGR基因，对其进行了生物信息学分析以及表达模式分析并调查了MeJA、YE及AgNO3三种诱导子对露水草悬浮细胞中20E生物合成的调控作用，为采用露水草悬浮细胞大规模生产20E奠定理论基础。
【作者】王秋军；
【导师】王剑文；
【作者基本信息】苏州大学，微生物与生化药学，2014，硕士
【关键词】露水草；20-羟基蜕皮甾酮；CaHMGR；悬浮细胞培养；诱导子；

【参考文献】
[1]陈燕,赵海,张德干,张晓丹.用于知识规则挖掘的粗集归纳中类化方法的研究[J].小型微型计算机系统,2005,03:461-465.
[2]陈钰,王捷,刘仲明.基于石墨烯及其衍生物的生物传感系统[J].分析化学,2012,11:1772-1779.
[3]张喜玲.香港离岸人民币对境内货币政策的影响研究[D].西南财经大学,金融学,2013,博士.
[4]邵海明.载波通信对智能电能表计量误差影响的研究[D].北京化工大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[5]万嵘.弓网动态特性仿真研究[D].华东交通大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[6]路超.三维数控弯丝机的关键机械结构研究与设计[D].西安建筑科技大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[7]王辉.生产性服务业创新发展与制造业效率增长研究[D].南京财经大学,产业经济学,2013,硕士.
[8]高凤.我国商业银行碳金融发展问题研究[D].山东财经大学,金融学,2012,硕士.
[9]易军.磷酸铁锂电池组能量管理系统研究与设计[D].西南交通大学,电气系统控制与信息技术,2014,硕士.
[10]陈锋莉.基于组件的库存管理系统的研究及开发[D].西北工业大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[11]徐林.矿井通风余动能发电研究[D].辽宁工程技术大学,流体机械及工程,2012,硕士.
[12]DilanthaThushara（苏贝）.贵金属高效非均相催化剂Pd-BTP/SiO_2和Pd-石墨烯在Suzuki和Heck反应中的应用[D].浙江大学,生物化工,2014,硕士.
[13]熊思.中国木质林产品受低碳壁垒影响的经济效应研究[D].江西财经大学,国际贸易学,2013,硕士.
[14]刘伟.教育公平问题的伦理研究[D].曲阜师范大学,伦理学,2004,硕士.
[15]包玉岩.城镇土地统一定级与估价研究[D].内蒙古师范大学,土地资源管理学,2012,硕士.
[16]张雷.大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤引起远隔肾组织中组织间粘附分子-1（ICAM-1）表达的影响及作用机制探讨[D].河北医科大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[17]侯娟娟.城乡义务教育师资分布失衡问题及对策[D].河北大学,教育学原理,2014,硕士.
[18]吴东林.中小城镇治安监控系统研究[D].南京理工大学,计算机技术,2011,硕士.
[19]王瑾.平江历史文化街区旅游意象研究[D].苏州大学,旅游管理,2014,硕士.
[20]吕峰.利用航空影像和LiDAR点云进行建筑物重建的方法研究[D].西南交通大学,地图制图学与地理信息工程,2013,硕士.
[21]孙玉环.秦岭终南山隧道自然风通风利用计算与仿真[D].长安大学,交通信息工程及控制,2014,硕士.
[22]孙峰.行政法下的违法所得研究[D].复旦大学,法律,2012,硕士.
[23]李大和,王超凯,李国红,彭奎.白酒生产检验（二十）杂质测定用标准溶液的制备[J].酿酒科技.
[24]郭永飞.Bi系氧化物薄膜分子束外延法制备及物理性能的研究[D].东北大学,材料物理与化学,2010,硕士.
[25]胡青.美国农业部网站新闻汉译的可读性研究[D].河北师范大学,翻译,2013,硕士.
[26]刘洪涛,童德利,陈世福.一种基于属性的异常点检测算法[J].计算机科学,2005,05:164-166.
[27]沈晓.唐钢高炉原料场计算机通讯网络[J].冶金自动化,1991,01:40-42+62.
[28]范秀为.叠氮光交联制备稳定的葫芦脲单层膜及其图案化[D].北京化工大学,2013.
[29]尹国成,张德干,郝先臣.一种可并行的二维小波变换算法[J].控制与决策,2002,02:139-142+147.
[30]单佳.面向公众的社会保险管理信息系统的设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[31]梁宇.基于最大流最小割理论的无线传感网络事件检测算法[D].山东大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[32]杜霖.YDH健身俱乐部创业成长策略研究[D].大连理工大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[33]胡齐凯.川西马井气田碎屑岩测井储层参数评价研究[D].成都理工大学,2004.
[34]王倩.T市移动公司绩效管理体系改进研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[35]李旭东.评价数字水印相似程度的公式分析及改进[J].自动化学报,2008,02:208-210.
[36]李军琴.我国食品安全监管策略的研究[D].内蒙古大学,公共管理,2014,硕士.
[37]张瑜.论莫扎特《A大调第23钢琴协奏曲》的创作特点与演奏风格[D].东北师范大学,音乐学,2012,硕士.
[38]李金颖.关于我国影子银行的法律监管研究[D].西北大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[39]陈卫祥,马琳,叶剑波,黄国创,王臻.二维MoS_2纳米片/石墨烯材料的制备及其电化学贮锂性能[A].中国硅酸盐学会固态离子学分会.第17届全国固态离子学学术会议暨新型能源材料与技术国际研讨会论文集[C].中国硅酸盐学会固态离子学分会:,2014:1.
[40]赵国玉.加快邮电发展,为开发西部、开发新疆提供优质的通信服务[J].世界电信.1998(05)
[41]记者冯卫东.只需一滴血即可测癌症和霍乱[N].科技日报,2015-06-25001.
[42]张伦玠.轮式自动导航机器人的研制[D].广东工业大学,机械电子工程,2004,硕士.
[43]杨利民.大连石油化工公司人力资源规划研究[D].大连理工大学,工商管理,2003,硕士.
[44]张毅.云南引种玛咖的药效学研究[D].云南中医学院,中西医结合基础,2012,硕士.
[45]李莲芝.中小物流企业融资租赁问题研究[D].长安大学,会计（专业学位）,2013,硕士.
[46]张清斌.Ka频段宽带卫星通信信道雨衰特性的研究[D].吉林大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[47]章乐.古代慎刑思想的司法困境[D].吉林大学,法律,2014,硕士.
[48]倪红.面料的性能与服装造型及生产的关系研究[D].苏州大学,纺织工程,2003,硕士.
[49]秦蔚蔚.高职院校任课教师胜任力评价体系研究[D].南京农业大学,工商管理,2012,硕士.
[50]杨盼着.试论中世纪的欧洲观念[D].上海社会科学院,世界史,2012,硕士.