生物分子化学发光检测新方法研究

【摘要】核酸和蛋白质等生物分子的检测是目前药物分析、临床诊断、环境监测、微生物检验等领域的一个研究热点,检测方法包括有电化学法、分光光度法、荧光法、同位素法和化学发光法(CL)等。不同方法各有优缺点,其中同位素法最为成熟,但存在一定的环境污染,对人的健康具有一定的损害。为替代同位素法,其它的非放射性技术,如有电化学法,酶法,荧光法,CL法等在近年来发展迅速。CL分析法不需光源,仪器设备简单、操作简便,具有极高的灵敏度,己成为近年来一个非常活跃的研究领域,目前已成功地应用在药学、化学、分子生物学、临床医学和环境学等诸多领域。为此,本论文采用CL分析法,利用金纳米粒子放大技术,模板识别技术和适配体技术,发展了多种具有创新意义的处理CL检测方法,实现了对生物分子的简单快速、高灵敏度和高选择性检测,整个论文由以下四部分构成：第一章：绪论绪论由两节构成,其中第一节简单介绍了多种信号放大技术在生物分子检测领域的研究进展及其意义,主要内容包括：纳米粒子放大技术,酶放大技术,杂交链式反应放大技术和滚环扩增放大技术等,并列举了近年来它们在该分析领域的部分典型示例；第二节阐述了本博士论文的研究目的、意义、主要内容及创新之处。第二章：基于金纳米粒子的生物分子化学发光检测新技术金纳米粒子是一种理想的生物标记物,制备工艺简单,性质稳定,且固定在金纳米粒子表面的生物分子仍能保持原有的生物活性,因此被广泛地应用在生物分子检测等研究领域。我们发现：金纳米粒子和汞离子都能催化羟胺-氯金酸反应,使金纳米粒子粒径增大或原位合成汞离子为核的金纳米粒子,随后催化鲁米诺-硝酸银(AgNO3)反应,产生CL信号。基于这个原理,我们建立了两种检测方法：一种采用金纳米粒子作为标记物,建立了夹心反应模式的特定序列DNACL检测方法,随后通过羟胺-氯金酸反应增大了金纳米粒子的粒径,得以放大CL信号,大幅提高了检测灵敏度,如通过两次放大,检测限可达300aM；另一种以核酸T碱基作为捕获探针,捕获汞离子后催化羟胺-氯金酸反应原位合成金纳米粒子,加入底物后产生CL信号,建立了汞离子的CL检测方法。该方法简单快速,对汞离子特异性高,灵敏度达10ppt,达到美国EPA要求的最新汞离子检出限。第三章：基于模板识别的生物分子化学发光检测新技术本章建立了一种基于模板识别的DNA和蛋白质的CL检测新技术。模板识别模式是将报告探针作为模板,在没有目标分子的情况下,报告探针与捕获探针之间的互补碱基不足以形成稳定的双链；只有当目标分子出现时,报告探针才能与捕获探针形成稳定的双链固定在载体上,产生CL信号。在第一节中,我们突破了传统夹心法的限制,采用模板识别模式,建立了一种适合短链DNA的CL检测方法。在该方法中,报告序列作为模板序列,只有在目标DNA存在的情况下,才能与具有8个碱基的捕获探针互补杂交,生成稳定的杂交复合物,产生CL信号。该方法简单、快速,灵敏度可以达到10amol,并且很容易拓展到多组分同时测定。在第二节中,我们将模板识别技术与适配体技术相结合,将适配体设计成报告探针,实现了蛋白质的简单、快速检测。在本方法中,只有当目标蛋白PDGF存在时,报告探针中的适配体将识别PDGF并发生构象变化,提供足够的碱基堆积力使报告探针与捕获探针形成稳定的双链固定到96孔板上,之后结合标记物后产生CL信号,而在没有目标蛋白PDGF存在的情况下,报告探针与捕获探针不能稳定结合。本节所构建的CL适配体检测新技术,PDGF的检测灵敏度可达10fM,且不需要使用抗体,应用范围广,能够很容易拓宽至其它具有适配体的蛋白质如凝血酶甚至小分子如腺苷、可卡因的检测。第四章：基于构象转化的免标记miRNA化学发光适配体检测技术本章结合适配体技术和分子信标技术,提出了一种具有创新意义的变构分子信标技术。第一节以链霉亲合素适配体-分子信标的构象转化为基础,构建了一种具有创新意义的基于磁性分离和适配体构象转化的免标记miRNACL检测新技术,同时引入了杂交链式反应放大技术,大幅提高了检测的灵敏度。第二节将酶循环放大的方法引入到miRNA的检测当中,采用DNA聚合酶扩增的链置换反应放大信号,同时还尝试了聚合酶-内切酶共同作用下的链置换放大。本章建立的检测方法,选择TMPG作为检测试剂,利用整个检测过程瞬时衍生、无需标记以及CL灵敏度高、线性范围宽和仪器简单的特点,克服了其它标记方法相对操作复杂、安全性差和仪器较为昂贵的不足,实现了let-7家族序列的简单、快速、高灵敏度检测。
【作者】蔡圣；
【导师】卢建忠；
【作者基本信息】复旦大学，药剂学，2013，博士
【关键词】特定序列DNA和RNA；蛋白质；汞离子；化学发光；金纳米粒子；模板识别；适配体；

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