伤寒沙门菌接合性质粒pR_(ST98)在动物体内外对细菌生物膜形成的影响

【摘要】目的：研究伤寒沙门菌接合性质粒pRST98在体内外对细菌生物膜（biofilm,BF）形成的影响，为预防和治疗BF相关性疾病及新型抗菌药物研发提供理论和实验依据。方法：一．体外实验部分1.pRST98在不同宿主菌中对生物膜形成的影响实验菌株包括携带一长度为100kb毒力质粒的鼠伤寒沙门菌（Salmonellaentericaserovartyphimurium,S.typhimurium）标准毒株χ3306、毒力质粒消除所得的S.typhimurium突变株χ3337、大肠埃希菌（Escherichiacoli,E.coli）K12W1485和质粒pRST98经接合转移导入S.typhimuriumχ3337和E.coliK12W1485后分别形成的接合子χ3337/pRST98和E.coliK12W1485/pRST98。按照实验室既往实验已确定的BF形成的适宜温度和时间，将受试菌分别在96孔板和24孔板中30℃培养3d后，结晶紫染色半定量法、扫描电镜（scanningelectronmicroscopy,SEM）和共聚焦激光扫描显微镜（confocallaserscanningmicroscopy,CLSM）分析和比较受试菌BF形成的情况。2.不同浓度IL-10对生物膜形成的影响课题组前期研究发现伤寒沙门菌接合性质粒pRST98在动物体内外可在一定程度上促进IL-10的产生。为探讨IL-10对细菌BF形成的影响，在鼠伤寒沙门菌培养液中分别加入浓度为1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml的IL-10，并设不加IL-10的对照组，30℃培养3d，用上述方法分析BF形成的差异。二．体内实验部分由于伤寒沙门菌具有严格的宿主专一性，只感染人，缺乏相应的动物模型。本部分选取了与伤寒沙门菌亲缘关系非常接近的鼠伤寒沙门菌作为研究对象，在动物体内研究了pRST98与BF形成的关系，为实时动态监测细菌在体内的播散情况，本实验室前期构建了将荧光素酶报告基因lux导入并整合到细菌染色体的生物发光菌。动物实验前首先分析了生物发光菌χ3337lux/pRST98、χ3337lux和不携带lux的χ3337/pRST98、χ3337的生长曲线及BF形成的差异。然后将6-8周BALB/c小鼠皮下注射结肠癌细胞CT26建立荷瘤小鼠，尾静脉注射生物发光菌S.typhimuriumχ3337lux/pRST98和χ3337lux，用感染χ3337lux/pRST98的非荷瘤小鼠做对照组。多模式小动物活体成像系统（In-VivoImagingSystem,IVIS）下实时动态观察小鼠感染后1d、2d和3d受试菌在体内的播散情况；于感染的第3d解剖小鼠，收集肿瘤、肝脏和脾脏，SEM观察肿瘤表面BF的形成情况；观察脏器形态学变化；平板菌落计数法检测肿瘤、肝脏和脾脏的集落形成单位（colony-formingunit,CFU）；将小鼠眼眶取血后，酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）测定血清中IL-10的表达量。结果：一．体外实验部分1.pRST98对细菌生物膜形成的影响：结晶紫染色、SEM及CLSM观察，S.typhimuriumχ3337/pRST98和E.coliK12W1485/pRST98细菌聚集成团，构成三维立体结构的较厚的BF，而不携带该质粒的S.typhimuriumχ3306、χ3337和E.coliK12W1485呈零散状分布于视野中，不形成或较少形成BF；BF形成半定量结果显示，携带pRST98的S.typhimuriumχ3337/pRST98和E.coliK12W1485/pRST98的OD570值大于不携带该质粒的S.typhimuriumχ3306、χ3337和E.coliK12W1485，差异具有统计学意义（P<0.05）；S.typhimuriumχ3306和χ3337的BF形成没有明显差异（P>0.05）。2.pRST98在不同宿主菌中BF形成能力的差异：结晶紫染色半定量法显示E.coliK12W1485/pRST98形成BF能力明显低于S.typhimuriumχ3337/pRST98，OD570值有统计学差异（P<0.05）；SEM和CLSM结果亦显示在S.typhimurium中pRST98对BF形成的促进作用强于在E.coli中的作用。3.不同浓度IL-10对BF形成的影响：与不加IL-10相比，加入浓度为1ng/ml的IL-10，细菌聚集成团，BF形成能力增加；IL-10浓度为10ng/ml时，细菌大量聚集，产生非常明显的胞外基质，且形成的BF非常致密，半定量显示差异具有统计学意义（P<0.05）；SEM观察发现，IL-10浓度为10ng/ml时，细菌紧密排列，形成厚膜状物，产生大量胞外基质。而当浓度为100ng/ml时，细菌聚集受到抑制，呈零散状分布于视野中，不形成或较少形成BF，半定量显示差异具有统计学意义（P<0.05）。不同浓度的IL-10对携带pRST98的鼠伤寒沙门菌BF形成的影响均强于未携带该质粒的菌株。二．体内实验部分1.荧光素酶报告基因lux对细菌生长及BF形成的影响：S.typhimuriumχ3337、χ3337/pRST98与带有lux基因的生物发光菌χ3337lux、χ3337lux/pRST98细菌生长曲线无差异；结晶紫染色半定量法分析结果表明，在96孔板内30℃培养3d的S.typhimuriumχ3337/pRST98与χ3337lux/pRST98，χ3337与χ3337lux两两之间OD570差异无统计学意义（P>0.05）。2.IVIS观察发光菌在小鼠体内的播散：结果显示，经由尾静脉感染细菌的荷瘤小鼠在感染后第3d发光菌聚集于荷瘤小鼠肿瘤部位，χ3337lux/pRST98发光强度明显高于χ3337lux。3.肿瘤表面BF形成差异：SEM结果显示，χ3337lux/pRST98感染组的荷瘤小鼠，χ3337lux/pRST98聚集于肿瘤表面，产生胞外物质，而χ3337lux感染组细菌呈零散分布。4.脏器形态学变化及活菌数：两感染组的荷瘤小鼠均出现肝脏和脾脏肿大，且表面有点状病灶，S.typhimuriumχ3337lux/pRST98感染组的脏器肿大和表面充血更严重。CFU计数表明，χ3337lux/pRST98感染组肿瘤、肝脏和脾脏的活菌数明显高于χ3337lux感染组，差异有统计学意义（P<0.05）。在两感染组中，肿瘤的活菌数明显高于肝脏和脾脏。5.IL-10表达差异：随感染时间延长，IL-10表达逐渐增加，且χ3337lux/pRST98组IL-10表达量明显高于χ3337lux组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1.伤寒沙门菌接合性质粒pRST98在鼠伤寒沙门菌和大肠埃希菌中均能促进细菌BF形成，但在不同宿主菌中存在异质性，即在鼠伤寒沙门菌中对BF形成的促进作用强于在大肠埃希菌中的作用。2.伤寒沙门菌接合性质粒pRST98可促进细菌在动物体内定殖并促进BF形成，加重感染。3.伤寒沙门菌接合性质粒pRST98对细菌形成BF的影响与IL-10具有一定的相关性。
【作者】阙凤霞；
【导师】吴淑燕；
【作者基本信息】苏州大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】沙门菌；接合性质粒；生物膜；IL-10；

【参考文献】
[1]宋敏.A Study on the English Versions of Government Work Reports from the Perspective of Translation Ethics[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[2]王建新.放射性~(125)I粒子联合化疗与单纯化疗治疗胃癌术后肝转移的对比研究[D].郑州大学,肿瘤学（专业学位）,2013,硕士.
[3]王晶.立体图像脆弱和半脆弱水印技术及其应用研究[D].宁波大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[4]王依姣.基于虚拟现实技术的爆破工程学习系统研究[D].云南师范大学,教育技术学,2013,硕士.
[5]吴亚琴.基于小波变换的粗晶材料超声检测研究[D].武汉纺织大学,物理电子学,2014,硕士.
[6]刘剑.计算智能在特种机械总体结构优化设计中的应用研究[D].南京理工大学,2004.
[7]刘桃康.重庆市大学校园景观空间演变研究[D].西南大学,园林植物与观赏园艺,2014,硕士.
[8]何东.李鸿章与中法战争[D].西南交通大学,专门史,2003,硕士.
[9]武振兰.我国城市规划听证制度的研究[D].中国政法大学,宪法学与行政法学,2004,硕士.
[10]谢凌玲.Arbin仪器公司在华子公司激励机制研究[D].中国地质大学,管理科学与工程,2003,硕士.
[11]刘浩然.高中生物教师“生物技术实践”教学能力的现状研究[D].沈阳师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[12]陆紫微.非负重状态下3.0T MR T2mapping及IDEAL成像在评价椎间盘退变中的应用[D].苏州大学,影像医学与核医学,2013,硕士.
[13]王慧.移动校园系统数据传输关键技术研究与实现[D].中国海洋大学,计算机技术（专业学位）,2014,硕士.
[14]吴锦前.使用有效管理计算机文件管理软件[J].中国传媒科技.2001(12)
[15]刘勇旭.高弹性丙烯酸酯聚合物的合成与应用[D].济南大学,高分子化学与物理,2012,硕士.
[16]石亚楠.跨国并购中跨国公司之东道国社会责任的完善[D].中共中央党校,经济法学,2013,硕士.
[17]蒋浩.再生混凝土框架梁抗震性能试验研究[D].北京建筑大学,结构工程,2013,硕士.
[18]蒋缓缓.利用磁控溅射制备固体氧化物燃料电池阴极功能层[D].中国科学技术大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[19]盛安冬,王远钢,刘健,戚国庆,郭治.航迹辨识系统中约束方差滤波的容许模型噪声[J].控制与决策,2001,05:553-556.
[20]饶媛媛,曾晖,王康平,刘兴亮,王强.锂离子电池富锂锰基正极材料的研究进展[J].电池工业,2014,03:157-162.
[21]周杨辉.网络密度、企业社会资本与管理创新绩效关系研究[D].浙江工业大学,技术经济及管理,2012,硕士.
[22]艾艳可.基于多视角特征的车型识别方法[D].北京交通大学,2014.
[23]田昱泽.河南省叶县现代农业发展研究[D].华中师范大学,农业推广,2014,硕士.
[24]赵福立.基于RBF海杂波微弱目标的检测与提取[D].吉林大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[25]卢娟.论舆论监督对警察权运行的影响[D].湖南师范大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[26]谢京.佛教在华传播策略对中国文化对外传播的启示[D].重庆大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[27]陈向宇.属性特征敏感问题6种RRT模型下二阶段整群抽样调查的统计方法及应用[D].苏州大学,流行病与卫生统计学,2014,硕士.
[28]曹淑真.基于OLAP与数据挖掘技术的单病种费用分析[D].浙江大学,生物医学工程,2013,硕士.
[29]徐兆华.高速高精度步进闭环控制系统的研究[D].中北大学,机动武器系统工程,2013,硕士.
[30]于晓蕾.论最佳关联在英语报刊新闻标题中的实现[D].沈阳师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[31]赵晓鹏.沈阳市城乡居民收入差距研究[D].辽宁大学,社会保障,2012,硕士.
[32]孙雪梅.新型敏感的取向碳纳米管/高分子复合材料[D].复旦大学,高分子化学与物理,2013,博士.
[33]潘雯雯.湖北省人口分布的时空格局及影响因素研究[D].华中师范大学,人文地理学,2014,硕士.
[34]魏兵.对土地估价的收益还原法和假设开发法的理论分析[D].吉林大学,国民经济学,2004,硕士.
[35]杨敬东.城市勘测院KC的发展战略研究[D].电子科技大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[36]吴茂刚.矢量控制永磁同步电动机交流伺服系统的研究[D].浙江大学,2006.
[37]管雯珺.大学生一般自我效能感、人际交往能力与社交焦虑、班级心理气氛之间的关系研究[D].华中师范大学,心理健康教育,2014,硕士.
[38]李剑锋.乔篑成书画鉴藏考论[D].首都师范大学,美术学,2014,硕士.
[39]安景.小功率光伏并网逆变器研究[D].北京交通大学,2014.
[40]陈英楠.基于财务角度的创业板上市公司IPO效应成因分析[D].东北师范大学,企业管理,2012,硕士.
[41]肖敏,史忠科.水雷出水模型突变的控制方法[J].自动化学报,2012,10:1609-1617.
[42]张彦峰.一种高带宽低噪声的ΣΔ小数频率合成器[D].国防科学技术大学,软件工程,2013,硕士.
[43]彭建.一种基于遗传算法的关联规则挖掘方法[J].计算技术与自动化,2005,02:75-77.
[44]陈燚涛,李朝晖.基于数字化模型的水轮机调速系统状态监测与分析[J].电力系统自动化,2005,09:72-76.
[45]张志超.串联式混合动力汽车动力系统参数匹配及性能仿真研究[D].长安大学,车辆工程（专业学位）,2014,硕士.
[46]王冀龙.智能新风机控制系统设计[D].燕山大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[47]张杰.基于资源共享视角下的住区开放性研究[D].西安建筑科技大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[48]林向义.虚拟现实技术在电力培训中的应用[D].大庆石油学院,计算机应用技术,2004,硕士.
[49]才秀吉.民国时期青海藏区的藏族土匪研究[D].西藏大学,中国少数民族史,2014,硕士.
[50]田苗.三维有序大孔聚阴离子型氧化物材料的制备及表征[D].长安大学,材料学,2014,硕士.