硫化氢通过CaMKKβ-AMPK信号通路抑制中枢神经炎症应答

【摘要】目的：硫化氢（hydrogensulfide,H2S）是重要的内源性气体信号分子，可以抑制中枢神经炎症，但机制不明。已有研究表明H2S可能通过核因子-kappaB（NF-κB）和p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）信号通路抑制中枢神经炎症。本课题的目的在于探索H2S是否通过腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase,AMPK）信号通路促进脑内炎症细胞—小胶质细胞（microglia,MG）向M2另类活化状态转化从而发挥抑制神经炎症应答的作用。方法：利用BV-2小胶质细胞系及小鼠原代小胶质细胞，通过脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激建立体外小胶质细胞神经炎症模型。利用三种结构不同的H2S供体（NaSH/GYY4137/ADT-OH）以及过表达内源性H2S合成酶胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase,CBS）的策略研究H2S抑制中枢神经炎症的机制。应用Griess试剂法通过检测炎症介质NO的生成探索H2S供体抑制小胶质细胞炎症应答的有效药物浓度范围及最佳效应浓度；应用WesternBlot法检测AMPK活化（磷酸化）、CBS表达及AMPK的上游激酶—Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶激酶β（Ca2+/calmodulindependentproteinkinasekinasebeta,CaMKKβ）表达水平的变化；应用实时荧光定量PCR（Real-timeQuantitativePolymeraseChainReaction,Q-PCR）和酶联免疫吸附实验（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）技术测定表征M1（促炎状态）/M2（另类活化状态）细胞因子表达水平的变化；同时应用AMPK和CaMKKβ抑制剂或siRNA干扰技术探索H2S抑制中枢神经炎症的作用是否依赖于AMPK/CaMKKβ。最后，通过侧脑室注射LPS建立小鼠中枢神经炎症模型，在动物水平验证H2S供体对LPS刺激导致的AMPK磷酸化及M1/M2细胞因子表达水平的影响；并应用免疫组织化学法观察磷酸化AMPK（p-AMPK）与小胶质细胞标记物Ibal的共定位情况，以明确H2S供体在动物水平对小胶质细胞活化状态及AMPK激活的作用。结果：与溶剂对照组相比较，无论BV-2细胞有无LPS诱导活化，H2S供体（NaSH/GYY4137/ADT-OH）和CBS过表达均增加其AMPK活化水平；同时，ADT-OH和CBS过表达均促进LPS活化的BV-2细胞向M2另类活化状态转化；AMPK抑制剂和siRNA均抑制ADT-OH促进活化BV-2细胞向M2另类活化状态转化。以上实验结果说明H2S通过促进AMPK活化抑制中枢神经炎症应答。肝激酶B1(1iver-kinaseB1,LKB1)是激活AMPK的上游激酶，但ADT-OH在不表达LKB1的HeLa细胞中也能促进AMPK活化；而CaMKKβ抑制剂和siRNA均抑制ADT-OH促进BV-2细胞AMPK活化及其向M2另类活化状态转化。这些结果表明，H2S通过CaMKKβ而不是LKB1激活AMPK信号通路发挥抑制神经炎症应答的作用。在LPS刺激小鼠原代小胶质细胞的模型上，ADT-OH也促进原代小胶质细胞AMPK活化及其向M2另类活化状态转化；AMPK和CaMKKβ抑制剂均抑制ADT-OH促进小胶质细胞AMPK活化及其向M2另类活化状态转化。在侧脑室注射LPS建立的小鼠中枢神经炎症模型中，ADT-OH和NaSH均促进小鼠小胶质细胞活化密集区域—脑外侧隔区复合体AMPK活化，并且ADT-OH抑制该区域脑组织M1细胞因子的表达而上调M2细胞因子的表达水平；荧光免疫组化结果显示在同时注射LPS和ADT-OH的小鼠脑外侧隔区复合体可见Ibal+细胞与p-AMPK共染。这部分结果从动物水平上证实H2S通过激活小胶质细胞AMPK抑制中枢神经炎症应答。结论与创新：H2S通过CaMKKβ-AMPK信号通路抑制中枢神经炎症应答。
【作者】周晓梅；
【导师】曹勇军；程坚；
【作者基本信息】苏州大学，神经病学，2014，硕士
【关键词】硫化氢；小胶质细胞；神经炎症应答；5-对羟基苯基-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮（ADT-OH）；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）；钙调素依赖蛋白激酶激酶β（CaMKKβ）；

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