Beclin1基因的选择性剪接研究及条件敲除小鼠的建立

【摘要】第一部分Beclin1基因的选择性剪接研究目的：研究儿童急性B淋巴细胞白血病697细胞系中的Beclin1基因的选择性剪接及其对自噬的调控作用。方法：（1）提取697细胞系的总RNA，逆转录成cDNA。（2）在Beclin1基因的ORF区的起始密码子上游和终止子的下游设计引物，以cDNA为模板，进行PCR扩增、测序和比对。（3）分析剪接体Del-E11产生的分子机制。（4）构建GFP-剪接体融合表达的慢病毒载体，研究其亚细胞定位。（5）构建剪接体融合表达的697细胞系，通过westernblot和Co-IP的方法检测Del-E11对细胞自噬的调控作用。结果：（1）在儿童急性B淋巴细胞白血病697细胞系中发现一个新的Beclin1基因剪接体，该剪接体第11号外显子缺失，导致翻译提前终止，形成的肽链和Beclin1相比在C端缺少了95个氨基酸。（2）成功构建Lenti-GFP-Beclin1和Lenti-GFP-Del-E11融合基因的慢病毒表达载体，包装病毒后，侵染Hela细胞，得到阳性的Hela-GFP-Beclin1和Hela-GFP-Del-E11细胞，westernblot检测结果表明融合基因正常转录并翻译成相应蛋白。（3）亚细胞定位实验结果表明Del-E11蛋白主要分布于细胞质中。（4）过表达Del-E11抑制697细胞系中的自噬活性。结论：（1）生物信息学分析表明，Beclin1基因的缺失突变体Del-E11是由于pre-mRNA选择性剪接时发生外显子跳跃形成的。（2）Del-E11蛋白与野生型的Beclin1蛋白在细胞质中均有分布，表明二者在亚细胞定位方面没有明显变化。（3）由于Del-E11蛋白与Vps34结合的能力下降，导致697-Del-E11细胞的自噬水平显著低于697-Beclin1细胞的自噬水平，表明Del-E11对自噬具有负调控作用。第二部分Beclin1基因条件敲除小鼠的建立目的：建立Beclin1基因条件敲除小鼠模型。方法：（1）NeoR滋养层细胞的制备。（2）限制性内切酶AsiSI线性化Beclin1打靶载体。（3）小鼠胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）的培养、ES细胞的电穿孔及阳性ES克隆的筛选和鉴定。（4）制备结扎公鼠及假孕雌鼠。（5）雌鼠动情周期的判定和超数排卵。（6）小鼠胚胎的获取、显微注射和胚胎移植。（7）嵌合体的筛选与繁育。（8）N4代Beclin1f/+小鼠的基因型鉴定与繁育。（9）Vav-Beclin1+/-小鼠的基因型鉴定。结果：（1）从144个中靶的ES细胞克隆中鉴定出18个阳性的ES细胞克隆。（2）选取3株阳性ES克隆，共注射145枚囊胚，移植给10只假孕雌鼠，产生24只嵌合体，其中雄鼠14只，雌鼠10只。（3）筛选出4只嵌合度在50%以上的雄鼠进行繁育，最终共获得19只N4代小鼠，其中有12只是Beclin1f/+小鼠。（4）获得4只Vav-Beclin1+/-小鼠。结论：成功建立Beclin1基因条件打靶小鼠模型，并在血液细胞中特异性地敲除Beclin1基因。
【作者】刘青青；
【导师】薛智谋；
【作者基本信息】苏州大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】Beclin1；可变剪接；自噬；免疫共沉淀；亚细胞定位；条件性基因敲除；Cre/loxP系统；

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