免疫激活骨髓间充质干细胞的旁分泌对成骨细胞功能的影响

【摘要】第一部分骨髓间充质干细胞的分离、鉴定及旁分泌功能检测目的：骨髓间充质干细胞（Marrowmesenchymalstemcells,MSCs）具有向成骨细胞、成软骨细胞、心肌细胞、成脂肪细胞等多谱系分化潜能。随着研究的深入，MSCs的旁分泌作用及免疫抑制活性逐渐引起广泛关注。在本研究中，我们首先使用IFN-γ和TNF-α联合刺激MSCs，然后通过检测MSCs条件培养基（MSC-CM）的生物活性因子的变化水平，来研究其旁分泌功能变化。方法：（1）收集无其他合并症的骨折患者骨髓，采用密度梯度离心法收集含有MSCs的低密度层，获取原代MSCs，采用流式细胞术进行细胞鉴定。（2）取第三代MSCs，在特定诱导剂的诱导下定向分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞，并通过特异性染色进行鉴定。（3）用炎症因子IFN-γ和TNF-α免疫激活干细胞，制备BM-MSCs条件培养基（MSC-CM）。（4）ELISA及CBA法分析BM-MSCs条件培养基（MSC-CM），检测HGF，VEGF和TGF-β含量及IL-2，IL-4，IL-6和IL-10含量变化。结果：（1）我们收集了8例无其他合并症的骨折患者骨髓，均培养出原代MSCs细胞，细胞原代培养时排列呈螺旋状或漩涡状。传代培养后，细胞基本保持长梭形的形态。流式细胞术检测到细胞表达CD44、CD73、CD90而不表达CD34。（2）通过茜素红染色、油红O染色、阿尔新蓝染色分别检测BM-MSCs成骨、成脂、成软骨分化能力，我们观察到茜素红染色的钙结节，油红O染色的脂肪小滴，阿而新蓝染成蓝色的硫酸多聚糖。（3）联合使用炎症因子IFN-γ和TNF-α预刺激BM-MSCs，条件培养基中IL-6,VEGF,HGF和TGF-β的含量显著升高(p<0.01)，但IL-2,IL-4和IL-10的含量没有显著变化(p>0.05)。结论：（1）骨髓间充质干细胞生长旺盛，传代以后纯化度可达90%以上，传至10代以上仍能保持固定的长梭形细胞形态。（2）BM-MSCs具有很强的多向分化特性，可作为细胞工程中理想的种子细胞。（3）IFN-γ和TNF-α预刺激干细胞后，BM-MSCs的旁分泌功能发生了显著的变化，其分泌IL-6、VEGF、HGF和TGF-β的作用显著加强。第二部分免疫激活后BM-MSCs对成骨细胞功能的影响目的：高能量损伤所致的难治性骨不连、骨缺损发生率较高，目前在治疗上仍有较大的困难。骨折不愈合与骨断端的成骨细胞数量和活性降低有关。我们前期的研究显示，炎症因子IFN-γ和TNF-α免疫激活MSCs后，其旁分泌功能发生了显著的变化，其中IL-6、VEGF、HGF和TGF-β的分泌量明显升高。在本研究中，我们用MSC条件培养基孵育成骨细胞来探索免疫激活后BM-MSCs的旁分泌对成骨细胞增殖、迁徙、分化及细胞骨架的影响方法：用IFN-γ和TNF-α预刺激MSCs，制备MSC条件培养基（MSC-CM）培养成骨细胞（MG63）。CCK8法检测MG63细胞增殖能力；细胞划痕法检测MG63细胞迁徙能力；鬼笔环肽染色法检测MG63细胞骨架；Real-timePCR法检测ALP、COLI及OCN基因的表达量变化；免疫荧光法检测OPN表达；茜素红染色检测其矿化能力。结果：在IFN-γ和TNF-α联合刺激的MSC条件培养基作用下，MG63细胞的增殖速度明显加快；细胞划痕结果示其迁徙能力显著提高（p<0.01）；诱导第4、7天后成骨细胞分化标志基因表达量明显增多(p<0.05)；免疫荧光染色示联合刺激组的OPN阳性细胞数明显升高；茜素红染色示IFN-γ+TNF-α组的MSC-CM诱导MG63细胞21天后钙结节形成更多，矿化沉积作用更强；鬼笔环肽染色显示细胞骨架未受影响。结论：经免疫激活后的MSC的旁分泌作用可以显著促进成骨细胞的增殖、迁徙、分化和矿化能力，从多个阶段加强成骨细胞的成骨能力，为临床应用MSC治疗骨质缺损指导了新方向。
【作者】李成；
【导师】周海斌；
【作者基本信息】苏州大学，骨外科学，2014，硕士
【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导分化；旁分泌；免疫激活；成骨细胞；骨化作用；

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