共刺激信号ICOSL/ICOS介导Th2极化与HSCs活化效应在血吸虫病肝纤维化形成中的作用

【摘要】由于血吸虫虫卵沉积导致的肝脏虫卵肉芽肿病变和继发性肝纤维化被认为是日本血吸虫病的重要病理损伤。研究表明，宿主在感染日本血吸虫的慢性致病过程当中，血吸虫可溶性虫卵抗原（Solubleeggantigen,SEA）介导的Th2极化在肝脏虫卵肉芽肿反应中的调节和诱发继发肝纤维化中发挥关键作用。肝星状细胞（Hepaticstellatecells,HSCs）的活化，使大量的细胞外基质（Extracellularmatrix,ECM）沉积在肝脏组织内是肝纤维化进程当中的关键环节。本研究中日本血吸虫病实验动物模型分别为：在FVB/NJ小鼠遗传背景的基础上构建的ICOS转基因（ICOStransgenic,ICOS-Tg）小鼠；并将FVB/NJ小鼠作为其野生型对照。探讨ICOSL/ICOS信号对感染宿主Th2型免疫应答、免疫病理及HSCs活化的影响，探究共刺激信号ICOSL/ICOS介导的Th2极化与HSCs的活化效应对日本血吸虫病肝纤维化形成的影响，为开辟能有效的控制肝纤维化的新途径提供坚实的理论依据。本论文研究分四个部分：一、ICOS-Tg小鼠感染血吸虫病变过程中Th2极化相关共刺激分子表达动态变化目的：探讨共刺激信号ICOSL/ICOS在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后，对与Th2极化有密切联系的ICOS、CD28、CD154等共刺激分子表达的影响。方法：分别在日本血吸虫感染前0周和感染后4周（早期）、7周（急性病变期）、12周（慢性期），运用流式细胞术分析观察ICOS、CD28、CD154等共刺激分子在ICOS-Tg及其野生型小鼠脾CD4+T淋巴细胞上表达水平动态变化。采用免疫组织化学法体内同期观察感染小鼠不同病期肝脏虫卵肉芽肿周围炎症性侵润细胞上相关共刺激分子表达水平动态变化。结果：流式数据表明，感染小鼠脾CD4+T淋巴细胞上共刺激分子CD28表达水平自感染后4周开始升高（46.51%），感染后7周达到峰值（78.70%），感染后12周有所下降，但表达水平仍维持在较高水平（60.01%）；而共刺激分子ICOS（38.77%）和CD154（30.53%）表达水平自感染后4周开始升高，感染后7周（ICOS:48.10%;CD154:50.74%）、12周（ICOS:57.90%;CD154：55.00%）仍处于逐渐升高趋势。免疫组织化学体内同期检测发现，共刺激分子ICOS、CD28、CD154在感染小鼠肝脏虫卵肉芽肿周围炎症性侵润细胞上的表达水平在感染后7周即处于较高水平（0.551；0.479；0.516,IOD/AOVI），感染后12周仍呈上升趋势（0.662；0.492；0.576,IOD/AOVI）。并且ICOS、CD28、CD154在ICOS-Tg小鼠脾CD4+T淋巴细胞上的表达水平均要高于同时期野生型小鼠（8.36～57.90vs5.51～41.21;27.33～60.01vs22.36～51.43;5.80～55.0vs4.73～41.21,%）；其在肝脏虫卵肉芽肿周围炎症性侵润细胞上的表达水平在感染后7周(0.551vs0.355;0.479vs0.349;0.516vs0.432,IOD/AOVI)、12周（0.662vs0.418;0.492vs0.431;0.576vs0.447,IOD/AOVI）亦高于同时期野生型小鼠。结论：在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫慢性致病过程当中，与Th2极化密切相关的共刺激分子ICOS、CD28、CD154的表达均呈逐渐上升趋势，特别是ICOS表达更为显著并可能影响相关共刺激分子CD28和CD154的表达。二、ICOS-Tg小鼠感染血吸虫病变过程中共刺激信号ICOSL/ICOS对宿主Th2极化的作用目的：探讨ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后，上调ICOSL/ICOS信号对宿主体内Th2极化的影响。方法：分别收集ICOS-Tg及其野生型小鼠感染前0周和感染后4周、7周、12周的脾淋巴细胞，收集经SEA刺激培养72h后的细胞上清，运用ELISA双抗夹心法检测观察上清中Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12和Th2型细胞因子IL-4、IL-13的表达水平动态变化。结果：感染小鼠脾细胞培养上清中Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12表达水平自感染后4周开始升高（38.98pg/ml；73.50pg/ml），感染后7周达到峰值（62.40pg/ml；119.96pg/ml），感染后12周表达下调（33.02pg/ml；93.36pg/ml），表明病程由急性期转为慢性期时，Th1型细胞因子的表达水平下调；而Th2型细胞因子IL-4、IL-13表达水平自感染后4周开始升高（11.49pg/ml；66.94pg/ml），感染后7周（23.04pg/ml；165.82pg/ml）、12周（41.89pg/ml；208.66pg/ml）呈上升表达趋势。Th2型细胞因子IL-4、IL-13在ICOS-Tg小鼠培养上清中的表达水平均要高于同时期野生型小鼠（3.98～41.89vs3.89～28.82；19.56～208.66vs15.49～165.38,pg/ml）。结论：在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫慢性致病过程当中，上调ICOSL/ICOS信号促进宿主的Th2型细胞因子的表达，进而增强Th2极化免疫应答反应。三、ICOS-Tg小鼠感染血吸虫病变过程中共刺激信号ICOSL/ICOS对宿主肝脏纤维化的作用目的：探讨ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后，上调ICOSL/ICOS信号对宿主肝脏纤维化的影响。方法：分别收集ICOS-Tg及其野生型小鼠感染前0周和感染后4周、7周、12周的血清，应用ELISA双抗夹心法检测血清中羟脯氨酸（hydroxyproline,HYP）、透明质酸（hyaluronicacid,HA）含量并观察其动态变化规律。采用Masson染色法观察感染小鼠不同病期肝脏纤维化程度的变化。运用免疫组织化学法体内同期检测观察Collagen-Ⅰ、α-SMA和TGF-β1等蛋白在感染小鼠不同病期肝组织中的表达水平动态变化。结果：随着病程的迁移，感染小鼠血清中HYP、HA的表达水平自感染后4周呈逐渐上升趋势（1.61～2.93,μg/ml;211.49～284.50,ng/ml;），肝脏纤维化程度加重，肝脏中Collagen-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1蛋白的表达水平亦逐渐上调（0.013～0.518;0.022～0.587;0.069～0.510,IOD/AOVI）。而HYP(1.61～2.93vs1.54～2.21,μg/ml)、HA(152.74～284.50vs145.97～224.93,ng/ml)在ICOS-Tg小鼠血清中的表达水平均要高于同时期的野生型小鼠；并且Collagen-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1等蛋白在ICOS-Tg小鼠肝组织中的表达水平在感染后7周(0.463vs0.332;0.550vs0.443;0.483vs0.312,IOD/AOVI)、12周（0.518vs0.374;0.587vs0.451;0.510vs0.356,IOD/AOVI）亦高于同时期的野生型小鼠。结论：在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫慢性致病过程当中，上调ICOSL/ICOS信号促进宿主的肝脏纤维化的形成。四、ICOS-Tg小鼠感染血吸虫病变过程中共刺激信号ICOSL/ICOS对宿主HSCs活化效应及肝纤维化的作用目的：探究ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫后，上调ICOSL/ICOS信号对宿主HSCs活化及肝纤维化形成的影响。方法：采用肝脏酶灌注充盈法和密度梯度离心法分离出感染前（0周）和感染早期阶段（4周、6周）、感染急性病变期（9周）ICOS-Tg及其野生型小鼠原代HSCs，运用台盼蓝拒染法鉴定分离的原代HSCs成活率；采用其在328nm波长紫外激发光下自发荧光特性和其在肝细胞中特异性表达神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）鉴定分离的原代HSCs纯度；原代HSCs培养7d后，用TrizolReagent试剂抽提总RNA；利用实时荧光定量PCR（RealtimefluorescencequantitativePCR）SYBR法检测Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1等基因的表达水平变化，观察HSCs的活化效应及对肝纤维化进程的调节作用。结果：分离的原代HSCs纯度达到90%，其成活率为95%，原代培养过程中细胞状态良好。随着病程的迁移，HSCs的活化程度逐渐增加，HSCs中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA、TGF-β1等基因的表达水平逐渐上调（0.621～1.093；0.312～0.576；0.706～1.078；0.760～1.138，gene/β-actin）。ICOS-Tg小鼠与HSCs活化相关基因α-SMA（0.706～1.078vs0.695～0.947,gene/β-actin）的表达均高于同时期野生型小鼠；ICOS-Tg小鼠HSCs中Collagen-Ⅰ（0.621～1.093vs0.583～0.832,gene/β-actin）、Collagen-Ⅲ(0.312～0.576vs0.309～0.446,gene/β-actin)、TGF-β1(0.760～1.138vs0.732～0.919,gene/β-actin)等基因的表达水平亦高于同时期的野生型小鼠。结论：在ICOS-Tg小鼠感染日本血吸虫慢性致病过程当中，上调ICOSL/ICOS信号促进宿主的HSCs的活化和肝纤维化的形成。本研究结果表明，共刺激信号ICOSL/ICOS对日本血吸虫感染后宿主的Th2极化及肝脏内HSCs活化具有重要的调节作用，并促进肝脏纤维化形成。ICOSL/ICOS信号的调控将可能作为下调或抑制血吸虫虫卵肉芽肿病变及肝纤维化进程的靶点。
【作者】梁松；
【导师】夏超明；
【作者基本信息】苏州大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】血吸虫病；日本血吸虫；ICOS转基因小鼠；ICOSL/ICOS信号；Th2极化；肝星状细胞；肝纤维化；

【参考文献】
[1]曹宇.无人机非线性自抗扰控制方法研究[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[2]罗艳青.基于图割的单幅户外图像影子检测[D].燕山大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[3]乔东义.李泽厚实践美学思想论要[D].安徽师范大学,美学,2004,硕士.
[4]杨赟赟.公司治理能够预测公司的市场价值吗？[D].西南交通大学,会计学,2013,硕士.
[5]韩恺,赵均,钱积新.电力系统机组组合问题的闭环粒子群算法[J].电力系统自动化,2009,01:36-40+69.
[6]记者吴长锋通讯员杨保国.中英科学家石墨烯研究获突破[N].科技日报,2014-03-14001.
[7]周兴堂.人身保险产品代理人销售误导研究[D].贵州财经大学,保险,2013,硕士.
[8]祝干干.论我国社会救助中的政府责任[D].安徽大学,宪法学与行政法学,2014,硕士.
[9]叶思诚.油茶适应低磷胁迫的根系生理响应[D].中南林业科技大学,经济林,2013,硕士.
[10]张东生.沙棘果皮渣黄酮提取及在粮油食品中应用研究[D].长春工业大学,食品科学,2013,硕士.
[11]薄丽洁.槐泗河水环境整治预测评价研究[D].扬州大学,农业水土工程,2012,硕士.
[12]周晶.公共财政支出绩效评价[D].华中师范大学,公共管理,2013,硕士.
[13]巩立珍.在初中化学教学中渗透绿色化学理念的研究[D].山东师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[14]杨迪珊.建筑结构设计总信息辅助确定与评价软件[D].厦门大学,建筑与土木工程,2014,硕士.
[15]傅子晋.苝酰亚胺/萘酰亚胺超分子低维功能材料的制备[D].湖南大学,材料学,2012,硕士.
[16]李晨.胃癌患者术前中性粒细胞淋巴细胞比率（NLR）与淋巴结转移相关性临床研究[D].中国人民解放军医学院,外科学,2013,硕士.
[17]宗许宁.G-M拖动系统起动与调速的研究及应用[D].大连海事大学,轮机工程,2013,硕士.
[18]薛莉.试论工伤保险追偿权[D].华东政法大学,民商法学,2012,硕士.
[19]牛彦斌.地理信息系统支持下的耕地地力等级划分[D].河北农业大学,土壤学,2004,硕士.
[20]蔡明成.关于290/470筒式钢球磨煤机噪声治理的研究[D].华东理工大学,动力工程,2014,硕士.
[21]齐美洲,傅智盛,范志强.茂金属催化剂的负载化[J].化学进展,2014,05:737-748.
[22]尹坤.基于语义信息的问题分类研究[D].西南交通大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[23]白惠文.氧化石墨烯改性有机硅树脂耐热性的研究[D].哈尔滨工业大学,2012.
[24]王庆爽.中国民族声乐艺术魅力[D].中国音乐学院,音乐学,2014,硕士.
[25]甘义锋.农村义务教育阶段物理教师素质发展研究[D].华中师范大学,学科教学,2013,硕士.
[26]耿琳琳.IGBT逆变弧焊电源电气特性模拟与试验研究[D].太原科技大学,材料加工工程,2014,硕士.
[27]高瑞林.基于Z变换FDTD方法的电磁波与微等离子体相互作用研究[D].哈尔滨工业大学,光学,2013,硕士.
[28]莫友坤.钢铁企业供氧优化决策支持系统研究[D].华中科技大学,2004.
[29]程少强.词联导航训练法对慢性非流畅性失语言语功能重塑的脑磁图研究[D].南京医科大学,康复医学与理疗学,2013,硕士.
[30]沙元昌.企业信息研究所知识管理初探[J].图书情报工作,2005,S1:27-30.
[31]许永涛.龚贤与黄宾虹笔墨程式的比较研究[D].西安美术学院,美术学,2014,硕士.
[32]赵怡轩.戏剧视角下的歌剧[D].中国音乐学院,音乐学,2012,硕士.
[33]姜开真.农村小学校本课程开发的个案研究[D].西南大学,课程与教学论,2013,硕士.
[34]杨一姝.移就辞格的认知机制探索[D].西安外国语大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[35]马立雄,倪洁.天猫、京东和当当发展战略的比较研究[J].商业经济,2014,07:77-79.
[36]周京华,刘劲东,陈亚爱,李津.大功率光伏逆变器的低电压穿越控制[J].电网技术,2013,07:1799-1807.
[37]王玉华,卢亚平,胡安慧,孙伟,焦奎.对苯二酚在金-石墨烯纳米复合膜修饰离子液体电极上的电化学检测[A].中国化学会.中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C].中国化学会:,2012:1.
[38]杨自厚,李宝泽,于永江.微机辅助氧气生产的计划调度[J].冶金自动化,1987,05:22-25+57.
[39]张步勇.低温等离子刀扁桃体、腺样体切除术后出血原因及预防的探讨[D].吉林大学,耳鼻咽喉科学,2014,硕士.
[40]刘肖健,徐瑶,吴艳燕.工业化背景下的竹藤编织产品的风格变迁[J].包装工程,2013,16:79-81+94.
[41]石彦芳.纳米受限下丝素蛋白的分子取向和力学性能研究[D].苏州大学,高分子化学与物理,2013,硕士.
[42]高路.上海通用的CRM[J].企业改革与管理,2002,05:41-42.
[43]李祥.绿原酸体外抑制肠道病毒71型的效应机制[D].苏州大学,临床检验诊断学,2013,硕士.
[44]董军,刘志敏,曹秀堂,李幼平,孙鑫,周亚春,张雁灵,解立新,徐武夷,王海涛,许红民.小汤山医院SARS诊疗信息数据库建设[J].中国循证医学杂志,2004,03:181-186+209.
[45]周宏伟.长输管线建设工程总承包文控管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[46]李军.日本原爆文学研究[D].东北师范大学,日语语言文学,2014,博士.
[47]李劲超.利乐公司供应链库存优化管理研究[D].内蒙古大学,工商管理,2013,硕士.
[48]高冬可.茅盾前期的期刊编辑活动研究[D].河南大学,新闻学,2004,硕士.
[49]李茜茜.三星和英特尔体育营销策略的对比分析[D].华东师范大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[50]许嘉宇.秃发鲜卑与乞伏鲜卑初步比较研究[D].内蒙古大学,专门史,2014,硕士.