不同血糖水平对冠状动脉搭桥术前大隐静脉细胞外基质相关基因表达的影响

【摘要】近年来,虽然经皮冠状动脉介入(percutaneouscoronaryintervention,PCI)技术的成熟使需行血管重建的冠心病患者数量明显减少,冠状动脉搭桥术(coronaryarterybypassgraftting,CABG)仍是世界范围内治疗冠心病最有效的手段之一,有着PCI无法替代的优势。目前,大隐静脉(Saphenousvein,SV)已经作为最常用的CABG手术桥血管应用多年,但是术后十年约50%会发生严重狭窄或阻塞,糖尿病(diabetesmellitus,DM)更被看做是增加CABG死亡率和术后并发症的独立危险因素,其高血糖水平对大隐静脉病变的进展和演变起到了重要作用。糖尿病患者的血管病变通常继发于细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的改变。因此,本实验旨在研究合并糖尿病的冠心病患者不同血糖水平下其大隐静脉中基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)及其组织抑制因子(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMPs)和ECM基因表达情况。本文由以下四部分组成：第一部分研究对象的选取及标本的获取目的依据糖尿病患者及血糖水平为分组依据,对研究对象进行筛选和临床资料收集,以尽可能减少其他因素对研究结果的影响。方法本研究共收集了复旦大学附属中山医院心外科行CABG手术治疗的冠心病患者130例。按术前糖尿病情况,结合其空腹血糖和糖化血红蛋白结果,分为：HG组(有2型糖尿病且无论是否治疗其空腹血糖均末较好控制在7.0mmol/L以下者,糖化血红蛋白较高有参考价值,54例)；LG组(有2型糖尿病但平时空腹血糖可长期控制在7.0mmol/L以下且糖化血红蛋白蛋白结果正常者,36例)和对照组非糖尿病患者,40例)。对上述患者进行临床资料收集,CABG术中获取大隐静脉标本。结果各组问仅血糖水平和蛋白尿有显著差异,年龄、性别等其他特征均相匹配。结论从三组研究对象的术前临床资料分析中我们可以发现,除血糖水平及蛋白尿外,无论性别、年龄还是吸烟史、高血压、高血脂等其他因素均无明显统计学差异,故可以尽可能减少上述多种因素对本研究结果的影响。第二部分不同血糖水平对冠状动脉搭桥术前大隐静脉细胞外基质相关基因表达影响的基因芯片分析目的通过细胞外基质和黏附分子基因芯片研究分析获得的大隐静脉标本细胞外基质相关基因的表达情况。方法患者分组和大隐静脉标本的获取同正文第一部分。运用TRIzol方法提取总RNA后,以总RNA为模板,应用GEArray芯片检测试剂盒合成生物素标记的cDNA探针,cDNA探针变性后与芯片上特异性的cDNA基因片段杂交,洗涤后经GEAblocking液封闭,再由抗生蛋白链菌素结合的碱性磷酸酶室温下孵育,用CDP-Star(?)化学发光底物进行化合光学检测。结果用ScanAlyze扫描,用GEArrayAnalyzer软件分析,分析HG组(或LG组)和对照组芯片上ECM相关基因荧光信号强度值,两者相比即得出Ratio值,Ratio值大于3者为基因表达有显著差异的细胞外基质相关基因。结果基因芯片的84个细胞外基质相关基因中,HG组有30个基因表达有3倍以上差异倍数,其中24个基因表达上调,6个基因表达下调；LG组则仅有21个基因表达有显著差异,其中16个基因表达上调,5个基因表达下调。结论在暴露于动脉系统增加的血流和灌注压之前,糖尿病患者的大隐静脉血管细胞外基质相关基因表达异常导致的细胞外基构失衡的病变过程就已经开始,而且其严重程度与患者术前长期血糖水平呈正相关；LG组糖尿病患者虽然可长期将血糖控制在正常范围内,使其细胞外基质相关基因的异常表达在数量和程度上都明显少于HG组患者,但是其与非糖尿病患者相比较仍有显著差异。通过基因芯片技术深入至RNA水平揭示了不同血糖水平对大隐静脉的细胞外基质相关基因表达的影响,从临床需要上出发,对进一步研究冠心病患者搭桥术后大隐静脉桥血管易于阻塞的机制有一定裨益。第三部分不同血糖水平对冠状动脉搭桥术前大隐静脉MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3蛋白表达影响的Westernblot法分析目的以Westernblot法进一步在蛋白质水平上验证基因芯片分析结果的可靠性,研究不同血糖水平对冠状动脉搭桥术前大隐静脉MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3蛋白表达量的影响。方法患者分组和大隐静脉标本的获取同正文第一部分。用RIPA裂解液提取大隐静脉组织总蛋白,取部分样品,SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳,将蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜。用含脱脂奶粉的TBST封闭液进行封闭后,分别加入MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3及β-actin(1:400稀释)一抗,孵育洗膜后加适量辣根过氧化物酶标记二抗,孵育漂洗后用Luminol(?)化学发光底物将其覆盖,取出PVDF膜,放在干净的滤纸上以去除剩余的化学发光底物溶液,而后将其转入干净的塑料袋中,驱除气泡,用X-射线底片曝光。底片经扫描仪透扫后凝胶分析软件分析,结果以MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3与β-actin灰度的比值分别表示其相对表达量。结果与HG组相比,LG组大隐静脉MMP-2和MMP-9蛋白的表达虽已明显减少,但仍高于对照组,且差异有统计学意义；同样,其TIMP-2和TIMP-3表达虽已较HG组明显增加,但仍与对照组结果有显著差异(P<0.05)。结论糖尿病患者大隐静脉中的MMP-2、MMP-9和TIMP-2、TIMP-3蛋白表达情况与其血糖水平相关,而又不仅仅与血糖水平有关。同时也进一步证实了基因芯片分析结果的可靠性。第四部分不同血糖水平对冠状动脉搭桥术前大隐静脉MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3蛋白活性影响的免疫组化法分析目的采用免疫组化法研究不同血糖水平对冠状动脉搭桥术前大隐静脉MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3蛋白活性的影响。方法患者分组和大隐静脉标本的获取同正文第一部分。石蜡切片脱蜡水化后,3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶,微波热处理修复抗原,正常小牛血清封闭非特异性抗原,分别滴加MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-3的鼠抗人多克隆抗体,孵育过夜后加入生物素化羊抗鼠IgG二抗,孵育30min后滴加DAB显色液,常规脱水、封固。棕褐色为阳性着色,PBS代替一抗做阴性对照。切片经显微摄像扫描后,将图像输入计算机,采用计算机图像分析测得平均光密度值(OD值),进行定量分析。结果相比于HG组,LG组大隐静脉的MMP-2和MMP-9蛋白活性均明显降低,但仍高于对照组,且该差异有统计学意义；而其TIMP-2和TIMP-3表达虽较HG组增加,但与对照组仍有显著差异(P<0.05)。结论糖尿病患者大隐静脉中的MMP-2、MMP-9和TIMP-2、TIMP-3蛋白活性与其血糖水平相关,即便血糖水平控制很好其病理改变仍然存在。
【作者】林子博；
【导师】王春生；
【作者基本信息】复旦大学，临床医学（专业学位），2013，博士
【关键词】冠状动脉搭桥手术；糖尿病；临床资料；大隐静脉；细胞外基质；基因芯片；westernblot；免疫组化；

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