“分子开关”在HBV基因拉米夫定耐药突变检测中的应用

【摘要】目的：研究硫化修饰引物和高保真DNA聚合酶介导的分子开关在HBV基因拉米夫定常见耐药突变位点检测中的应用。方法：文献资料显示乙肝患者最为常见的耐药突变位点主要集中于HBV基因的pol聚合酶基中一段500bp的核酸序列之内。人工合成包含HBV基因所有常见药物耐药突变位点的核酸序列，并克隆至PUC57载体得到包含HBV基因所有常见耐药突变位点的突变模板1（204位耐药突变为YVDD）；通过重叠延伸PCR方法定点突变突变模板1的204位使其突变为（YIDD）并将得到的PCR片段克隆至PMD-19T载体测序鉴定得到包含HBV所有常见耐药突变位点的突变模板2（204位耐药突变为YIDD）；提取HBV患者血浆游离DNA并设计特定引物，扩增得到野生型HBV基因片段，将其克隆至PMD19-T载体并经测序鉴定得到野生模板。依据HBV基因序列设计针对M204V，M204I，L180M，V173L四个拉米夫定常见耐药突变位点的突变检测引物使其与突变模板配对而与野生模板不配对。对于突变检测引物在其3’端及次3’端进行硫化修饰。以高保真DNA聚合酶及硫化修饰的引物所构成的突变敏感分子开关分别对上述四个常见的耐药突变位点进行PCR检测。比较突变敏感分子开关对突变模板及野生模板的“开”及“关”作用，并通过对普通PCR及荧光定量PCR反应条件及反应体系的优化，确定所建立的检测平台的检测敏感度与检测灵敏度。结果：本课题成功建立了HBV基因拉米夫定四个常见药物耐药突变位点（M204V,M204I,V173L,L180M）的分子开关的突变检测平台。分子开关对于配对的突变模板可扩增出特异性产物，对于野生模板则无扩增产物或仅在很高拷贝数时出现。将突变模板及野生模板以10倍为单位逐级稀释，获得质粒拷贝数为107-101的不同浓度。本课题所建立的突变敏感分子开关检测平台对于M204V的检测灵敏度达到100拷贝，特异性达到1000拷贝；对M204I检测灵敏度达100拷贝，检测特异性高达105拷贝；对L180M检测灵敏度达10拷贝，检测特异性达1000拷贝，对V173L检测灵敏度达10拷贝，检测特异性达104拷贝。并且成功建立了HBV拉米夫定耐药的多重PCR检测平台对上述四个检测位点其检测灵敏度达100拷贝，检测特异性达1000拷贝。结论：高保真DNA聚合酶介导的突变敏感分子开关，对已知突变的检测有较高的灵敏度和特异性，可以检测微量的突变，本课题所构建的突变敏感分子开关检测体系可以检测拉米夫定治疗的HBV患者微量的耐药突变，对于乙肝病人临床用药指导及个体治疗方案的调整有重要的意义。
【作者】孙爱娟；
【导师】李凯；
【作者基本信息】苏州大学，药理学，2014，硕士
【关键词】HBV；耐药突变；分子开关；突变检测；

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