水稻矮秆突变体及其回复体中Ds插入位点与转座行为的分子分析

【摘要】随着水稻基因组全核苷酸序列测定工作的完成，功能基因组学研究已成为水稻分子生物学研究的重要内容。构建突变体库是研究水稻功能基因组学的一条重要途径，常用的突变体库构建方法有物理和化学诱变、插入突变、基因沉默等。其中，利用Ac/Ds系统构建水稻突变体库的方法得到了广泛运用。株高是水稻等粮食作物一个十分重要的农艺性状，直接影响到农作物的丰产、耐肥和抗倒伏性能。本研究室经过多年对粳稻品种Dongjin的Ac/Ds插入突变株系的栽培，从中筛选到一株具有Ds插入且表型矮化的矮秆突变体（Dwarfmutant，DM），经栽培后出现株高表型部分回复的回复突变体（Revertanttype，RT）。本研究对该突变体及其回复体中Ds插入位点与转座行为进行了分子分析，取得了以下两个方面的主要结果。一、对矮秆突变体进行初步的表型鉴定；基于TAIL-PCR技术分离了矮秆突变体Ds插入位点的侧翼序列，并利用生物信息学手段，对Ds标记基因及其编码蛋白展开分子鉴定，结果显示：1.与野生型（Wild-type，WT）相比，矮秆突变体表现为植株矮化，旗叶倾角扩大，其平均株高45.9cm（野生型79.0cm），旗叶倾角75.6°（野生型25.3°）。2.基于TAIL-PCR技术，从矮秆突变体基因组DNA中分离克隆到Ds插入位点侧翼序列，通过NCBI-BLAST在线分析显示，Ds插入在水稻第3号染色体上（BAC克隆序列OSJNBa0054H04.28，登录号AC106887.3）。3.此Ds标记基因包含4个外显子和3个内含子，Ds插入在其第4外显子上。该基因编码产物为氧化还原酶，共有549个氨基酸残基，从第401到第497个氨基酸是一个高度保守的2OG-Fe（II）氧化还原酶蛋白结构域。4.对该氧化还原酶进行分析，BLASTP寻找同源蛋白，SWISS-MODEL分析此蛋白及其关联蛋白的高级结构，发现此蛋白由9个α-螺旋和13个β-折叠结构组成，与一些赤霉素氧化酶（GA3ox、GA20ox）具有相似的蛋白空间结构。以上结果表明，矮秆突变体（DM）矮化表型源于Ds元件（4.6kb）在氧化还原酶基因第4外显子上的插入。经过分析，推测此基因可能是一个新的编码GA氧化酶的基因，通过影响GA的合成来维持水稻的正常株高。二、对矮秆突变体（DM）进行栽培，后代出现株高表型部分回复的回复突变体（RT）。对回复突变体进行表型鉴定，同时，基于TAIL-PCR技术以及利用生物信息学手段，对其Ds转座行为和新的插入位点展开分子鉴定，结果显示：1.回复突变体的平均株高74.1cm（野生型79.0cm），旗叶倾角44.1°（野生型25.3°），株高表型部分回复到正常。2.Ds以“内切酶模式”转座机制在回复突变体的氧化还原酶基因上发生切离，并在Ds原初插入位点残留序列为“CATCATGA”的8bp转座足迹。3.利用生物信息学软件FGENESH和GeneMark.hmm分析，发现8bp足迹残留导致氧化还原酶基因第4外显子被分隔为2个分别长168和327bp的外显子，增加1个新的内含子（长83bp），且编码产物减少为524个氨基酸残基。利用软件DNAMAN和SWISS-MODEL分析发现，8bp足迹残留后的氧化还原酶在减少了部分无规卷曲结构的同时多出一个α螺旋结构。4.基于TAIL-PCR技术，通过选用不同的简并引物，在回复突变体基因组中扩增并分离到2条Ds转座后新的插入侧翼序列，定位在水稻第2号染色体（PAC克隆P0477B05，登录号AP005310.3）和第6号染色体上（BAC克隆B1206D04，登录号AP006616.2）。5.第2号染色体上的Ds标记基因由7个外显子和6个内含子组成，推定其编码产物为烟草胺氨基转移酶；该酶含439个氨基酸残基，从第64到第428个氨基酸，是一个高度保守的AAT蛋白结构域，属于天冬氨酸转氨酶家族。第6号染色体上的Ds标记基因由6个外显子和5个内含子组成，编码衰老相关蛋白；该蛋白包含242个氨基酸残基。以上结果表明，Ds从氧化还原酶基因上切离后，插入于水稻基因组第2、6号染色体上。其转座行为不同于传统的“剪切-粘贴”机制，表现出“剪切-复制-粘贴”的现象。经分析，2个新的Ds标记基因的编码产物（烟草胺氨基转移酶与衰老相关蛋白）均与水稻株高的维持无直接关系，初步推测，回复突变体株高表型的回复可能是由于Ds元件在氧化还原酶基因的切离所致（8bp足迹残留没有对氧化还原酶基因的核心序列造成影响，蛋白仍具活性）。
【作者】赵丁丁；
【导师】孙丙耀；
【作者基本信息】苏州大学，植物学，2014，硕士
【关键词】水稻；矮秆突变体；Ds插入；TAIL-PCR；回复突变体；转座足迹；GA氧化酶；

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