氧化应激在亚砷酸钠诱导人永生化角质形成细胞（HaCaT）适应性反应中的意义

【摘要】目的探讨低剂量亚砷酸钠染毒诱导人永生化角质形成细胞(HumanHaCaTKeratinocytes,HaCaT)适应性反应中氧化应激和Keap1/Nrf2-ARE信号通路的表达及其意义。方法1．染毒剂量确定：以HaCaT细胞为研究对象，用0.1、0.15、0.6、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μM亚砷酸钠(NaAsO2)进行细胞染毒，采用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞增殖率。通过增殖曲线和GraphPadPrism6软件计算亚砷酸钠染毒半数抑制浓度（halfmaximalinhibitoryconcentration,IC50），从而确定后续诱导适应性反应实验的预处理剂量和冲击剂量。2．实验分组：将用于实验的HaCaT细胞分为预处理组和无预处理组。预处理组HaCaT细胞在加入含0.15μM亚砷酸钠的细胞培养液培养24h后，换用含10μM亚砷酸钠的细胞培养液继续培养0、4、8、12、24和36h；无预处理组待HaCaT细胞处于生长对数期时，直接换用含10μM亚砷酸钠的细胞培养液继续培养0、4、8、12、24和36h。3.氧化应激指标检测：实验染毒终点收集细胞，采用流式细胞仪检测HaCaT细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平，采用ELISA方法检测HaCaT细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的变化。4.Keap1/Nrf2-ARE抗氧化通路相关蛋白检测：实验染毒终点收集细胞，通过Westernblot方法检测Keap1/Nrf2-ARE信号通路发挥抗氧化作用的关键蛋白核转录因子红细胞系-2p45(NF-E2)相关因子-2(nuclearfactorerythroid-2p45-relatedfactor2,Nrf2)、Nrf2的胞浆抑制蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-likeECH-associatedprotein1,Keap1)和Nrf2的胞核竞争蛋白BTB-CNC异体同源体1(BTBandCNChomology1,BACH1)在HaCaT细胞胞浆和胞核中的表达情况，以及HaCaT细胞中抗氧化相关酶类的表达情况，包括血红素单加氧酶(hemeoxygenase1,HO-1)蛋白水平和细胞总超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活力改变情况。结果1．不同剂量亚砷酸钠对HaCaT细胞增殖的影响：与无预处理组相比，≤2.5μM亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞相对增殖率增加，其中0.15μM组的增殖率增加最明显，差异具有统计学意义(P<0.05)；大于2.5μM亚砷酸钠染毒组HaCaT细胞相对增殖率明显减小(P<0.05)，计算得亚砷酸钠IC50为9.077μM。2．低剂量亚砷酸钠诱导HaCaT细胞ROS和MDA的改变：随着亚砷酸钠染毒时间的延长，预处理组HaCaT细胞内ROS和MDA水平先上升后下降，其中ROS水平在12h达到峰值，MDA水平在24h达到峰值，均比无预处理组ROS和MDA水平达到峰值时间（分别为8h和12h）要延后，并且ROS和MDA的峰值水平显著低于无预处理组(P<0.05)。3．低剂量亚砷酸钠诱导HaCaT细胞Keap1/Nrf2-ARE通路表达的改变：（1）亚砷酸钠染毒不同时间对转录因子Nrf2蛋白水平的影响：随着亚砷酸钠染毒时间的延长，预处理组HaCaT细胞核中Nrf2蛋白水平随染毒时间延长呈先下降后上升趋势，在8h达到峰值，峰值时间比无预处理组（12h）提前，并且峰值水平高于无预处理组，差异具有统计学意义(P<0.05)；另外，预处理组细胞核Nrf2蛋白在8h的水平明显高于同时间点无预处理组(P<0.05)。预处理组HaCaT细胞浆中Nrf2蛋白水平随染毒时间延长而增加，在8h达到峰值，在8、12和36h的蛋白水平显著高于无预处理组(P<0.05)。（2）亚砷酸钠染毒不同时间对HO-1蛋白水平和SOD酶活力的影响：随着亚砷酸钠染毒时间的延长，HaCaT细胞内HO-1蛋白水平增加，呈先上升后下降趋势，在8、12、24和36h的HO-1水平皆显著高于0h组(P<0.05)。预处理组HO-1蛋白水平增加较快，在12h达到峰值，峰值时间较无预处理组(24h)提前。预处理组HaCaT细胞内SOD水平先下降后上升，在12h达到峰值，较无预处理组达峰值时间(8h)延迟，SOD酶活力峰值水平高于无预处理组峰值，差异具有统计学意义(P<0.05)；另预处理组SOD酶活力水平在0、8、12和24h时间点均明显高于无预处理(P<0.05)。（3）亚砷酸钠染毒不同时间对Keap1和BACH1蛋白水平的影响：随着亚砷酸钠染毒时间的延长，预处理组HaCaT细胞浆中Keap1蛋白水平先上升后下降，在0、24和36h的表达水平皆低于无预处理组，差异具有统计学意义(P<0.05)。预处理组HaCaT细胞核中Keap1在8h达到峰值，峰值时间比无预处理组（12h）提前，并且峰值水平明显高于无预处理组(P<0.05)；另外，预处理组细胞核Keap1蛋白在8h和12h的表达水平显著高于同时间点无预处理组(P<0.05)。随着亚砷酸钠染毒时间的延长，预处理组HaCaT细胞浆中BACH1蛋白水平呈先上升后下降趋势，在8h达到峰值，峰值时间比无预处理组（24h）提前，并且BACH1蛋白在4和8h的表达水平均高于无预处理组，差异具有统计学意义(P<0.05)。预处理组HaCaT细胞核中BACH1蛋白水平随染毒时间延长而增加，在8h达到峰值，达到峰值时间比无预处理组（24h）提前，并且峰值水平明显高于无预处理组(P<0.05)；另预处理组细胞核BACH1在8h的表达水平显著高于同时间点无预处理组(P<0.05)。结论低剂量亚砷酸钠染毒诱导HaCaT细胞适应性反应过程中启动Keap1/Nrf2-ARE信号通路，降低后续高剂量亚砷酸钠导致的氧化应激水平。
【作者】许熙国；
【导师】安艳；
【作者基本信息】苏州大学，卫生毒理学，2014，硕士
【关键词】亚砷酸钠；氧化应激；适应性反应；Keap1/Nrf2-ARE；信号通路；人永生化角质形成细胞；

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