家蚕质型多角体病毒（BmCPV）基因组片段7（S7）功能的研究

【摘要】家蚕质型多角体病毒（Bombyxmoricypovirus，BmCPV）是家蚕幼虫的主要病原微生物之一，能感染家蚕中肠细胞导致家蚕发生中肠型脓病，引起养蚕歉收。BmCPV基因组由10个dsRNA节段组成，S7节段编码结构蛋白VP7。本研究用VP7抗体通过免疫组织化学、Westernblotting检测了VP7在细胞内的定位、切割、表达时相，探讨了抑制vp7基因表达对BmCPV增殖的影响，通过Co-IP筛选了VP7与宿主细胞互作候选蛋白，并通过质谱对候选蛋白进行了鉴定，研究结果为深刻理解S7节段编码的VP7的功能、BmCPV与宿主的互作提供了新的线索。1.BmCPVVP7的原核表达和多克隆抗体的制备将vp7基因克隆进原核表达载体pET-28a(+)，构建了重组质粒pET-28a-S7。将重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株并诱导表达，结果显示重组蛋白VP7的分子量约为55kDa。将重组蛋白VP7免疫成年小鼠，制备VP7抗体。Westernblotting检测结果显示制备的多抗具有特异性，可用于VP7的检测。2.BmCPVVP7的切割分析为了分析BmCPVVP7是否被切割，将vp7基因克隆进pIZT/V5-His载体，构建了重组质粒pIZT/V5-His-S7，该质粒转染家蚕BmN细胞，经抗生素Zeocin筛选获得表达VP7重组蛋白的稳定转化细胞。用His6抗体进行Westernblotting检测发现，转化细胞表达的重组蛋白VP7的分子量约为65kDa，比理论分子量略大。用VP7抗体进行Westernblotting检测发现，除了65kDa的重组蛋白VP7外，还能检测到分子量约为35kDa的2种蛋白（V35a,V35b），推测VP7在转化细胞中被切割成了分子量较小的蛋白。对感染BmCPV6d的BmN细胞和感染BmCPV8d的中肠后部组织进行Westernblotting检测，结果显示，在感染的BmN细胞和感染的中肠组织中，均可检测到分子量约为55kDa的蛋白条带，除此之外，在感染的BmN细胞中也可检测到分子量约为20kDa的蛋白条带，在感染BmCPV的中肠组织中也可检测到25kDa和20kDa的蛋白条带。说明VP7在病毒感染的细胞中被切割，但在感染的培养细胞和感染的中肠组织中切割方式存在差异，VP7在感染细胞与非感染细胞中的切割方式也存在不同。用VP7抗体对BmCPV病毒粒子进行Westernblotting检测，发现除可检测到55kDa的特异性条带外，还能够检测到分子量约38、25和10kDa大小的3个蛋白条带，推测BmCPV病毒粒子中存在不同切割程度的VP7。3.VP7的亚细胞定位及BmCPV感染过程中VP7蛋白水平的变化分析对感染BmCPV8d的中肠后部进行组织免疫荧光检测发现，绿色荧光集中在细胞质中，表明VP7定位在细胞质。感染BmCPV1d～12d后的中肠后部组织蛋白定量后进行Westernblotting检测，在感染7d的组织中，可检测到20kDa左右的蛋白条带；感染8d时，VP7表达量增加，可检测到55、25和20kDa蛋白；感染9d时，VP7表达量达到高峰，除可检测到55kDa蛋白外，也可检测到28、25、20和18kDa蛋白条带；10、11和12dVP7的表达与第9d相似，但多检测到1个分子量约为22kDa蛋白。推测VP7在病毒增殖的不同时期，其切割方式可能存在细微差异。4.抑制vp7基因表达对病毒增殖的影响为了进一步探究vp7基因表达对病毒增殖的影响，3龄起家蚕注射VP7-siRNA(1μg/头)，24h后，人工感染BmCPV，48h后检测vp7和vp1的RNA水平，结果显示vp7基因和vp1基因的相对表达水平分别下降了5.2倍和15.4倍；BmN培养细胞分别转染3种VP7-siRNA24h后，人工感染BmCPV，48h后检测vp7和vp1的RNA水平，结果显示vp7基因相对表达量分别下调17.5、9.7和4.7倍，vp1基因的相对表达量分别下调13.0、6.3和3.0倍，表明抑制vp7基因表达，可抑制BmCPV病毒的增殖。5.VP7相互作用宿主蛋白的筛选与鉴定为了研究VP7与宿主蛋白的相互作用，利用免疫共沉淀和质谱分析筛选鉴定与VP7互作的候选宿主蛋白，共鉴定到18种与VP7互作的宿主蛋白；信息分析结果显示，这些蛋白涉及到糖代谢、胆固醇代谢、核苷酸降解、线粒体与细胞质之间的阴离子转运、围食膜形成、免疫应答、转录调节、JH结合、蛋白降解、细胞周期与凋亡等各个方面。
【作者】何蕾；
【导师】贡成良；
【作者基本信息】苏州大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】BmCPV；S7片段；VP7；蛋白裂解；基因表达；细胞定位；功能分析；相互作用；

【参考文献】
[1]李婧.兰州地铁深基坑支护结构及开挖方案研究[D].兰州理工大学,结构工程,2014,硕士.
[2]钱智勇.基于数据仓库的科研管理信息系统开发研究[J].图书馆学刊,2004,03:3-5.
[3]张蕴玉.量块计量保证方案(MAP)[J].宇航计测技术.1992(04)
[4]艾宁,姜哲,徐茜,钱琪枫,伍希,王家炜.氨基改性层状双氢氧化物的制备及其二氧化碳吸附机理[J].化工学报,2013,02:616-623.
[5]李莉.中医五志图片刺激材料库的初步建立[D].北京中医药大学,社会医学与卫生事业管理,2014,硕士.
[6]伍小刚,俞波,姚吉文,苏理.3种同步接口在光纤纵差保护中的设计实现[J].电力系统自动化,2006,20:77-80.
[7]吴晓东.发热伴血小板减少综合征病毒非结构蛋白NSs抑制天然免疫及促进病毒增殖机制的研究[D].南京大学,内科学,2014,博士.
[8]季冬晓.论执政条件下中国共产党的党内监督[D].中共中央党校,党的学说与党的建设,2004,硕士.
[9]赵灿.博来霉素和甲氧檗因传感新方法研究[D].青岛科技大学,2013.
[10]缪幸福.HAP法回收废水中磷的反应条件优化控制研究[D].安徽工程大学,环境工程,2012,硕士.
[11]吕旌源.浅析唐寅绘画中的笔墨艺术[D].湖南师范大学,美术（专业学位）,2013,硕士.
[12]田英.高电光转化效率MEMS红外光源的制备及其性能研究[D].中北大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[13]彭军.球孢白僵菌对胡瓜钝绥螨和朱砂叶螨的影响[D].西南大学,农业昆虫与害虫防治,2013,硕士.
[14]吴江,宋晗,周锐,陈宗基.基于扩展影响图的超视距空战辅助决策方法[J].控制与决策,2010,11:1669-1674.
[15]李焕.SM22α泛素化对PDGF-BB诱导的VSMC增殖的影响[D].河北医科大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[16]田良灿.金属矿山岩层控制述评[J].长沙矿山研究院季刊.1982(02)
[17]李强.岩爆发生过程试验研究及裂隙影响分析[D].中国矿业大学,岩土工程,2014,硕士.
[18]谢朝霞.焦化废水水中氰化物和色度处理的试验研究[D].太原理工大学,环境工程,2004,硕士.
[19]郑晓东.类风湿关节炎（RA）患者的临床特征及中医证候特点的研究[D].北京中医药大学,中医学,2014,硕士.
[20]周正.特大山地组团城市停车换乘（P&R）研究[D].重庆交通大学,交通运输规划与管理,2012,硕士.
[21]梁健康.论“法律与文学”运动的后现代特征及其理论价值[D].华东政法学院,法律,2003,硕士.
[22]王秋莉.乡镇公务员职业道德建设研究[D].江西财经大学,行政管理,2013,硕士.
[23]周岳凌.湖南省山区高速公路边坡生态景观恢复研究[D].湖南农业大学,园艺,2012,硕士.
[24]池凯.骨髓间充质干细胞复合人脱细胞真皮修复大鼠创面的实验研究[D].延安大学,外科学,2014,硕士.
[25]赵鹏飞.生产安全突发事件下个体与群体心理交互作用及对策研究[D].中国矿业大学（北京）,安全管理工程,2014,博士.
[26]郑正龙.聚碳酸酯（PC）表面改性技术研究[D].合肥工业大学,流体机械及工程,2013,硕士.
[27]冼文俊.深圳港城城市综合体业态组合研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[28]王晓禹.DLH公司绩效考核优化设计研究[D].河北工业大学,工商管理,2013,硕士.
[29]沈玉芬.移动互联网中端透明的协议无关NAT穿越机制[D].北京交通大学,下一代网络（专业学位）,2013,硕士.
[30]安天琛.海南东寨港红树林大型底栖动物纤维素酶的鉴定及纯化[D].海南大学,海洋生物学,2014,硕士.
[31]郑力祥.基于出行信息的城市多模式出行交通分配研究[D].北京交通大学,2014.
[32]傅彦祺.载脂蛋白A-I模拟肽D-4F对血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响[D].福建医科大学,内科学,2014,硕士.
[33]姚海霞.静电纺丝法制备超吸水纤维的研究[D].天津工业大学,材料学,2004,硕士.
[34]吴飞.隧道建设项目成本控制数据仓库系统构建[D].哈尔滨理工大学,系统工程,2012,硕士.
[35]宋丽.基于决策树的组合分类器的研究[D].西安电子科技大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[36]许晓宁.对高一学生进行阅读策略培训的实证研究[D].河北师范大学,学科教学,2012,硕士.
[37]王祎.基于马氏超椭球学习机的文本分类算法研究[D].渤海大学,运筹学与控制论,2014,硕士.
[38]程伟.基于BSS系统的实时计费子系统研究[D].河北科技大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[39]丁澜翔.概念史视域中的美术史[D].中央美术学院,美术学,2013,硕士.
[40]毛新国.小麦族A、S、D二倍体种全长cDNA文库构建及序列初步分析[D].中国农业科学院,2004.
[41]何语.零售商主导型供应链的契约协调研究[D].西南交通大学,物流工程,2013,硕士.
[42]闫佳楠.论家务劳动价值的补偿[D].大连海事大学,法律,2013,硕士.
[43]严翔,王立德,杨宁,申萍.MVB-Ethernet网关设计与时延分析[J].北京交通大学学报,2014,02:106-111.
[44]金雷.转化正极材料LiF/Fe的制备及电化学性能研究[D].哈尔滨工业大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[45]阮思烨,李国杰,孙元章.多端电压源型直流输电系统的控制策略[J].电力系统自动化,2009,12:57-60+96.
[46]杨小龙.连通井随钻系统信号处理模块的设计与实现[D].广东工业大学,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[47]薄飞.云桂铁路小寨隧道反坡施工排水技术研究[D].西南交通大学,地质工程,2014,硕士.
[48]李颂杰.内部营销在服务业应用研究[D].华侨大学,企业管理,2004,硕士.
[49]杨偃成.国内善意谎言研究回顾与展望[J].怀化学院学报,2014,03:96-99.
[50]史丽萍,曹雪祥,陈丽兵,夏正龙,王攀攀.改进的STATCOM相内直流电容电压平衡控制策略[J].电力系统自动化,2015,02:119-126.