多聚乳糖胺型N-聚糖与结肠癌细胞株SW620耐药性的关系探讨

【摘要】目的5-氟尿嘧啶(5-FU)是临床治疗结肠癌的最常用药物之一。本文在5-FU处理结肠癌细胞SW620后，分析多聚乳糖胺链的表达水平变化；并检测合成多聚乳糖胺链的糖基转移酶β3GnT8基因和蛋白水平的表达变化。同时为了进一步阐明多聚乳糖胺链及糖基转移酶β3GnT8与结肠癌细胞5-FU耐药性的相关性，以耐药细胞株SW620/5-FU为研究对象，检测耐药细胞株中多聚乳糖胺链和糖基转移酶β3GnT8的表达水平，初步探讨多聚乳糖胺链及糖基转移酶β3GnT8与结肠癌细胞耐药性的关系。方法(1)MTT药物敏感实验来测定5-FU处理SW620细胞后细胞的半数致死率(IC50)；Hochest33258试剂盒和流式细胞术检测5-FU处理SW620细胞后细胞凋亡程度变化；流式细胞术检测5-FU处理SW620细胞后细胞周期变化；流式细胞术和Lectin-blot分别检测5-FU处理SW620细胞后细胞表面及细胞内多聚乳糖胺链的表达变化；碱性磷酸酶试剂盒ALP/AKP检测5-FU处理SW620细胞后细胞分化指标碱性磷酸酶(ALP/AKP)的活性变化；Western-blot检测糖基转移酶β3GnT8和CD147在蛋白水平的表达情况。(2)利用逐步递增浓度间歇作用法筛选耐药细胞株SW620/5-FU；MTT药物敏感实验测定耐药细胞株SW620/5-FU的耐药指数；Real-timePCR检测耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)基因的mRNA水平表达；Western-blot检测耐药细胞株SW620/5-FU和SW620中肿瘤干细胞标志物CD133蛋白表达；Hoechst33258试剂盒和流式细胞术检测两株细胞的凋亡情况；Real-timePCR和Western-blot分别检测耐药细胞株SW620/5-FU及SW620中β3GnT8的mRNA和蛋白水平表达；流式细胞术和Lectin-blot分别检测两株细胞的细胞表面和细胞内多聚乳糖胺的表达。结果(1)5-FU处理SW620细胞后，细胞的凋亡程度升高，细胞周期主要抑制在S期，细胞表面及细胞内全部多聚乳糖胺链的表达均降低，且有时间依赖性，细胞分化程度升高；5-FU处理SW620细胞后，Western-blot检测β3GnT8和CD147的蛋白水平表达变化，结果表明两者表达均有显著增加。(2)筛选得到耐药细胞株SW620/5-FU，耐药指数RI为7.62。其P-gp基因mRNA表达水平明显高于SW620细胞；两种细胞中肿瘤干细胞标志物CD133蛋白水平表达变化不大，无统计学意义；SW620细胞凋亡水平高于SW620/5-FU细胞；以上结果均表明耐药细胞株筛选成功。β3GnT8的基因和蛋白水平表达在两株细胞中差异显著，其在SW620/5-FU细胞中表达明显高于SW620细胞；流式细胞术和Lectin-blot检测两种细胞中细胞表面和细胞内的多聚乳糖胺链的表达，结果显示多聚乳糖胺链在SW620/5-FU细胞中表达水平明显高于SW620细胞。结论(1)5-FU能够促进SW620细胞的凋亡，将细胞周期主要抑制在S期；5-FU能够抑制多聚乳糖胺链的表达，同时也抑制了糖基转移酶β3GnT8和细胞表面糖蛋白CD147的蛋白水平表达。推测5-FU处理SW620细胞后，因其抑制了β3GnT8的蛋白表达而影响多聚乳糖胺链的合成，细胞凋亡水平也进而增强，同时降低了CD147的表达。(2)筛选得到的5-FU耐药细胞株SW620/5-FU高表达P-gp，SW620/5-FU细胞表面及细胞内多聚乳糖胺链表达水平均高于SW620细胞，β3GnT8基因和蛋白水平表达也高于SW620细胞，而细胞凋亡水平低于后者。两细胞凋亡程度不同及多聚乳糖胺链表达差异的原因可能是由于合成多聚乳糖胺链的糖基转移酶β3GnT8的表达变化引起，进而推测β3GnT8可能促进肿瘤细胞产生耐药性。
【作者】高利平；
【导师】周迎会；
【作者基本信息】苏州大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】5-FU；多聚乳糖胺链；β3GnT8；结肠癌；耐药性；

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