草鱼IL-8基因在炎症反应中的功能研究

【摘要】目的白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）是一种CXC趋化因子，可激活和趋化嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞及淋巴细胞等，在炎症、肿瘤等多种疾病中具有重要作用。草鱼是我国主要的淡水养殖品种之一，但其易受病原微生物感染，发生炎症乃至死亡。本研究在已克隆到草鱼IL-8基因的基础上，对草鱼IL-8重组蛋白（rgcIL-8）的功能进行鉴定。利用制备的抗草鱼IL-8多克隆抗体，检测了草鱼生理及病理条件下体内各免疫相关组织中IL-8蛋白分泌量的变化，旨在探讨鱼类IL-8在草鱼炎症反应中的功能。方法首先，应用Ni-NTA亲和层析技术纯化原核表达的rgcIL-8，并通过Transwell趋化实验和体内刺激实验研究rgcIL-8的生物学功能；其次，以纯化的rgcIL-8为免疫原，制备抗草鱼IL-8多克隆抗体，应用Westernblot方法验证特异性、间接ELISA测定效价，并采用棋盘滴定法，确定抗原抗体的最佳工作浓度，建立可检测草鱼体内IL-8蛋白的间接ELISA方法；最后，利用制备的多克隆抗体，运用荧光免疫技术分析正常草鱼及LPS刺激后草鱼各免疫相关组织中天然IL-8蛋白的分泌及分布。结果Transwell趋化实验结果显示，rgcIL-8对草鱼头肾中性粒细胞具有明显的趋化活性，且这种趋化作用呈浓度依赖性；体内刺激实验显示，rgcIL-8可引起受刺激部位局部发生白细胞的聚集，出现急性炎症反应类似的组织病理变化。多克隆抗体检测结果表明，实验所得多克隆抗体可特异性识别IL-8蛋白（rgcIL-8），效价可达1:40000,并建立了可检测草鱼体内天然IL-8蛋白的间接ELISA方法。草鱼各免疫相关组织中gcIL-8表达情况的研究结果显示，gcIL-8在各免疫相关组织呈组成型表达。LPS诱导后，各免疫相关组织gcIL-8含量均显著升高。其中，体肾、肝脏及肠道于刺激4h，IL-8蛋白表达量迅速升高至最高值，头肾、鳃和脾脏等组织中IL-8蛋白含量于刺激后12h才达到最高值，胸腺则在刺激4h、12h时没有明显变化，24h略有升高，显示gcIL-8在草鱼免疫调节中的重要作用。结论本研究验证了草鱼IL-8在细胞水平上的趋化活性以及机体水平上的致炎功能，成功制备了特异性较好、效价较高的IL-8多克隆抗体，建立了可以检测草鱼体内IL-8的间接ELISA方法；并首次探讨了生理及病理状况下草鱼IL-8在各免疫相关组织中的分泌及分布情况，初步明确了IL-8在草鱼炎症反应中的功能，为进一步研究鱼类IL-8作用机制、开发鱼类抑炎靶向性药物提供基础。
【作者】赵杰；
【导师】宋学宏；
【作者基本信息】苏州大学，水生生物学，2014，硕士
【关键词】草鱼；IL-8；原核表达；炎症；多克隆抗体；

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