下调泛素表达对人肺癌细胞辐射敏感性的影响及作用机制研究

【摘要】目的探讨泛素分子在非小细胞肺癌中的表达，转染抑制泛素基因表达的shRNA-UBB、UBC质粒联合X射线对人非小细胞肺癌A549和H1299细胞生长和放射敏感性的影响及机制研究，在动物体内验证下调泛素表达的致放射增敏作用。方法通过免疫组化法检测泛素在肺癌及癌旁组织中的差异表达，并通过体内、外实验研究下调泛素对非小细胞肺癌的放射敏感性的影响及其机制：（二）体外实验：1、设计沉默泛素基因表达的shRNA-UBB和shRNA-UBC，用RT-PCR及Westernblot法验证shRNA的沉默效果；2、MTT法及克隆形成实验检测转染抑制泛素基因表达的shRNA-UBB，shRNA-UBC，shRNA-UBB/UBC（联合转染shRNA-UBB和shRNA-UBC）对肺癌A549和H1299细胞的增殖及放射敏感性的影响；3、流式细胞计数法测定下调泛素表达对人肺癌H1299细胞的凋亡和周期分布的影响；4、Western-blot法测定上述干预处理后细胞凋亡、周期、DNA损伤相关蛋白表达水平的改变；5、细胞免疫荧光法检测辐射诱导的细胞γH2AX清除能力的变化。（三）体内试验：1、裸鼠皮下建立人非小细胞肺癌移植瘤模型，按实验要求分组。测量肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，计算各组的肿瘤生长抑制率；2、检测增殖指标Ki67表达水平的变化。结果泛素在非小细胞肺癌中的表达明显高于癌旁组织，成功设计并转染shRNA下调泛素的表达。体外实验结果：1、RT-PCR结果显示shRNA-UBB-4(shRNA-B4)及shRNA-UBC-2（shRNA-C2）的抑制泛素基因表达的效果比较明显，蛋白水平抑制率达76%，因此选择这两种shRNA质粒进行后续功能实验的研究；2、分别在A549和H1299细胞中转染shRNA-UBB，shRNA-UBC及shRNA-UBB/UBC，MTT检测结果为shRNA-UBB/UBC能明显抑制H1299细胞的增殖（p<0.05），而分别转染shRNA-UBB，shRNA-UBC时其抑制作用不及联合转染组明显;在A549细胞中，shRNA-UBB/UBC能抑制其增殖（p<0.05）,但其细胞生长抑制率低于H1299（67.3%VS.32.8%,24h,32.9%VS.16.5%，48h）；3、克隆形成实验检测细胞放射敏感性结果提示：H1299细胞单纯照射组和照射联合shRNA-UBB/UBC组的平均致死剂量（D0）分别为1.40和0.97Gy，准域剂量Dq分别为1.99和1.42，shRNA-UBB/UBC对H1299细胞的放射增敏比（SER）为1.44，而对A549细胞的放射增敏比（SER）为1.05；4、进一步研究下调泛素表达联合X射线对H1299细胞凋亡的影响，结果表明6GyX射线联合下调泛素表达（shRNA-UBB/UBC）组细胞凋亡率明显增加，细胞凋亡率由8.79%增至30.44%（P<0.05）。基因组DNA凝胶电泳分析，泛素下调（shRNA-UBB/UBC）加照射组与单纯X射线照射组比较，基因组DNA中180bp左右凋亡片段明显增多，与流式细胞仪检测结果一致，下调泛素表达促进辐射诱导的细胞凋亡；5、下调泛素表达处理后，6GyX射线诱导的H1299细胞γH2AX清除能力下降；6、联合转染shRNA-UBB/UBC可显著增加H1299细胞的G1期阻滞，联合X射线作用下，在相同照射剂量条件下，联合转染shRNA-UBB/UBC对H1299细胞的周期分布没有影响；7、Western-blot结果显示，转染shRNA-UBB/UBC联合X射线照射后能明显降低H1299细胞的抗凋亡蛋白Bcl-2，p-AKT，cyclinD1及NF-κB的表达水平。NF-κB的抑制蛋白IκB磷酸化水平降低（IκB蛋白磷酸化后经泛素蛋白酶系统降解，而后NF-κB活化），从而转位入胞核内的NF-κB蛋白水平降低。体内实验结果：1、成功构建裸鼠的H1299细胞移植瘤模型，实验过程中，裸鼠的体重无明显变化；2、shRNA-UBB/UBC+IR组的H1299细胞裸鼠移植瘤的体积与单纯照射组相比显著减小，差异具有统计学意义（P<0.05）；与单纯照射组比较，shRNA-UBB+IR组、shRNA-UBC+IR组、shRNA-UBB/UBC+IR组的肿瘤生长抑制率分别：(51.55±10.85)%,(70.26±5.66)%,(74.61±7.59)%,(79.31±6.48)%。结论泛素在非小细胞肺癌中高表达；转染shRNA-UBB，shRNA-UBC下调人非小细胞肺癌A549和H1299细胞后出现明显的细胞增殖抑制作用，其对H1299细胞的增殖抑制作用较A549细胞显著；下调泛素表达能明显增加人非小细胞肺癌H1299细胞的放射敏感性（SER=1.44），而在A549细胞中不存在该效应（SER=1.05）；下调泛素表达可显著增加X线诱导的人非小细胞肺癌H1299细胞的凋亡作用并降低其DNA损伤修复功能；下调泛素表达可显著增加H1299细胞的G1期阻滞，联合X射线作用下，在相同照射剂量条件下，体内泛素水平对H1299细胞的周期分布没有影响；下调泛素表达联合X射线照射通过降低H1299细胞的p-AKT，cyclinD1及NF-κB的表达，抑制NF-κB活化并入核在下调泛素表达所致的对H1299细胞放射增敏过程中发挥着重要作用；下调泛素表达联合X射线作用在不影响裸鼠体重的情况下，对人非小细胞肺癌H1299细胞的裸鼠移植瘤的生长呈现显著的抑制作用。
【作者】唐益庭；
【导师】曹建平；张舒羽；
【作者基本信息】苏州大学，放射医学，2014，硕士
【关键词】下调泛素表达；肺癌；放射敏感性；细胞凋亡；DNA损伤修复；

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