日本血吸虫病疗效考核诊断抗原的研究

【摘要】血吸虫病是一种人畜共患寄生虫病，它威胁全世界近7亿人口的健康。我国是日本血吸虫病的主要流行区，50多年的综合防治工作使我国的血吸虫病流行得有效的控制，但2010年的统计数据显示全国仍有7个省453个县有血吸虫病流行，有血吸虫病人32.5万人，有螺面积37万公顷，血吸虫病依然是危害我国人民身体健康的重要公共卫问题。目前我国的血吸虫病流行区主要分布在以湖沼型流行区为主的江苏、安徽、江西、湖北、湖南5省及以山区丘陵型流行区为主的四川、云南2省，这些血吸虫病流行地区基本上是水位变化快的长江沿岸水网地区，以及地形复杂的大山区，血吸虫病的流行特点是：人群感染度低，临床症状不典型；螺情复杂，难以被彻底消灭；自然界血吸虫保虫宿主的种类众多。通过传统的综合性防治措施要实现彻底控制这些地区的血吸虫病流行十分困难，如果防治工作稍有松懈，螺情、疫情就会反复，血吸虫病大规模的暴发流行就有可能卷土重来。传染源的控制是血防工作的重点，我国的血吸虫病防治策略已转移到以消灭传染源为中心的综合防治措施上来。因此，建立有效的血吸虫感染诊断方法、及时发现血吸虫病传染原、既而采取有效的治疗措施是实现消灭传染原这一目标的关键，亦是当前血吸虫病防治科研工作的重点。粪检查虫卵和粪便毛蚴孵化，肠组织活检是血吸虫病最为可靠、经典的病原学诊断方法，但是这些方法比较费时、费力。患者感染度的下降，慢性病人和晚期病人肠粘膜增厚，进入虫卵肠腔的数量减少，方法的敏感性愈来愈低，容易漏检，难以满足现场防治工作的需要。血吸虫寄生于人体血液循环系统，其生长发育、新陈代谢过程中不断地向宿主体内排泄分泌自身蛋白成分，并刺激宿主免疫系统产生免疫反应，免疫反应的主要表现之一就是宿主体内产生抗血吸虫抗原特异性抗体反应。患者体液系统中出现血吸虫的蛋白成分或抗血吸虫抗原的特异性抗体（尤其是参与抗原依赖性短寿抗体反应者）是体内存在血吸虫现症感染的客观指征，检测这些特异性抗原或抗体及其水平的动态变化具有血吸虫感染的诊断与疗效考核价值。发展敏感特异的血吸虫循环抗原检测方法及参与短寿抗体反应抗体的检测方法，满足血吸虫病日常临床诊断与现场防治工作的需要是当前血吸虫病免疫学诊断研究的热点。目前短寿抗体反应检测方法的研究尚处于对诱导短寿抗体反应的抗原进行鉴定的阶段，循环抗原检测方法虽然已有大量的研究报道，但现有方法的敏感性仍不能满足防治工作的需要。为建立具有诊断与疗效考核价值的检测参与短寿抗体反应抗体或循环抗原的免疫学诊断方法，本研究在已有的研究基础上采用酵母外分泌表达方法在酿酒酵母中对日本血吸虫23kDa膜蛋白分子的大亲水肽段（Sj23HD）进行了表达，制备了纯化的重组Sj23HD-HSA融合蛋白，并对其诱导的抗体应答类型及诊断潜能进行了研究。同时，采用生物信息学与肽微阵列芯片检测方法对日本血吸虫成虫高丰度排泄分泌抗原成分的抗原表位进行了预测与验证，构建和表达了由多个主要抗原表位组成的日本血吸虫多表位蛋白，制备一批抗这些表位的特异性单克隆抗体。为进一步发展高效的参与短寿抗体反应抗体检测方法及循环抗原检测方法奠定了基础。第一部分：日本血吸虫23kDa膜蛋白的大亲水肽段与人血清白蛋白融合蛋白(Sj23HD-HSA)的酵母表达载体的构建、融合蛋白的制备及其免疫学特性分析一）日本血吸虫23kDa膜蛋白大亲水肽段与人血清白蛋白的融合蛋白（Sj23HD-HSA）酵母外分泌表达载体的构建采用重叠PCR技术制备了由日本血吸虫23kDa膜蛋白大亲水肽段(Sj23HD)基因与人血清白蛋白成熟肽基因组成的融合蛋白基因（Sj23HD-HSA）,将此基因定向克隆到中间载体pGEMT-MCS中，构建重组质粒Sj23HD-HSA/pGEMT-MCS。DNA序列分析证实融合蛋白基因序列正确，并被正确地克隆到中间载体pGEMT-MCS中的酵母表达组合调控元件中，与人血清白蛋白（HSA）信号肽进行了框内融合。采用限制性内切酶Not1对重组质粒Sj23HD-HSA/pGEMT–MCSDNA进行消化，制备含有Sj23HD-HSA基因的真核蛋白表达组合调控元件片段。将此片段与经过限制性内切酶Not1线性化的酵母表达载体pWX530进行连接，成功地构建了重组酵母表达质粒Sj23HD-HSA/pWX530。二）Sj23HD-HSA融合蛋白的酿酒酵母表达、纯化与免疫反应性大量制备重组酵母表达质粒Sj23HD-HSA/pWX530DNA，经电转化入酿酒酵母宿主菌中，转化产物转种到Leu缺乏的SD平板上生长，以筛选含有Sj23HD-HSA/pWX530质粒，能自营养的酿酒酵母转化子。随后，将此酿酒酵母转化子接种到YEPD液体培养基中,30℃培养1周，SDS-PAGE分析显示表达上清液中有分子量与预期大小（73kDa）相似的蛋白条带，采用SPSepharoseXL离子交换层析从表达上清液中制备了纯化的重组Sj23HD-HSA融合蛋白。免疫印渍分析显示该融合蛋白可以为日本血吸虫病人血清、重感染兔、鼠血清所识别，但不能被健康人、健康兔、健康鼠血清及华支睾吸虫病人血清所识别，提示该重组融合蛋白具有天然的免疫原性，并具有较好的诊断特异性。三)Sj23HD-HSA融合蛋白的免疫诊断价值制备治疗前、感染期间与治愈后不同时间点的血吸虫感染兔、鼠血清。以酵母表达的重组Sj23HD-HSA融合蛋白检测上述不同时间点血清样本中抗体IgG水平的动态变化，同时以可溶性虫卵抗原为对照。检测结果显示，血吸虫感染鼠及家兔血清抗Sj23HD-HSA蛋白的抗体IgG水平在的治疗后的初期继续上升，至治疗后2周达到最高水平，随后逐渐下降，至治疗后16周，部分小鼠、家兔的抗体水平达到阴性临界值。抗SEA抗体水平在治疗后亦呈下降的趋势，但下降幅度小。未治疗小鼠、家兔血清抗Sj23HD-HSA的抗体水平无明显下降。这一结果初步提示血吸虫感染小鼠、家兔抗Sj23蛋白抗体反应为短寿抗体反应，检测参与这一特异性短寿抗体反应的抗体具有诊断与疗效考核潜能。以重组Sj23HD-HSA为检测抗原，检测132份血吸虫病人血清，阳性率为89%；检测30份肝吸虫病人血清，交叉反应率为0%；检测10份肺吸虫病人血清，交叉反应率为50%；检测80份健康人血清，假阳性率为0%。同时，以SEA为检测抗原，检测132份血吸虫病人血清，阳性率为97.73%；检测30份肝吸虫病人血清，交叉反应率为16%；检测10份肺吸虫病人血清，交叉反应率为90%；检测80份健康人血清，假阳性率为0%。提示与SEA相比，重组Sj23HD-HSA蛋白用于血吸虫病诊断具有较好的特异性，但对于来自肺吸虫流行区的患者需注意鉴别诊断。第二部分日本血吸虫高丰度排泄分泌蛋白特异性表位的鉴定，多表位蛋白基因设计及表达，单克隆抗体的制备一)日本血吸虫高丰度循环抗原特异性优势表位的鉴定采用生物信息学方法对日本血吸虫排泄分泌物中高丰度蛋白的抗原表位进行预测，根据生物信息学预测分值、及其与人类同类蛋白同源性，选择12个分值高、同源性低的抗原表位，通过重叠设计扩展到20个表位肽段。在蛋白质芯片的基片上直接立式合成这20个抗原表位肽段，制成肽微阵列芯片。将每一个肽段分别与血吸虫病人血清、肝吸虫病人血清和健康人血清进行反应，经过化学发光检测，确定了其中7个表位肽段能与血吸虫病人血清发生较强反应，但与健康人、华支睾吸虫病人血清反应弱或不反应。进一步分析发现这7个肽段分属SjEnolase、SjGAPDH和SjGST28蛋白分子上的重叠肽段，最终确定为3个有效表位肽段。蛋白构象同源建模结果显示这三个表位肽均位于相应源蛋白空间结构的表面。二）多表位蛋白基因的设计，单表位、多表位融合蛋白表达载体的构建与融合蛋白制备通过设计，将以上筛选到的三个抗原表位肽、一个Sj23蛋白的表位肽以一个柔性甘氨酸连接子连接在一起，形成一个线性的人工血吸虫多表位蛋白（SjMEP）。人工合成编码这个蛋白的基因片段，以及三个单表位肽的基因片段。通过定向克隆的方法将SjMEP基因插入到表达质粒pGEX-5X-1中，使之与载体上的谷胱甘肽转移酶（GST）基因进行框内融合，构建能表达GST-SjMEP融合蛋白的重组表达质粒SjMEP/pGEX-5X-1。重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达重组GST-SjMEP融合蛋白，通过Glutathionesepharose4B亲和层析胶制备纯化的可溶性GST-SjMEP融合蛋白。ELISA分析显示重组GST-SjMEP融合蛋白能与血吸虫病人血清发生较强的免疫反应，提示重组GST-SjMEP融合蛋白具有血吸虫蛋白的天然免疫原活性。将单表位SjEnolaseepitope,SjGAPDHepitope和SjGST28epitope基因定向克隆到表达载体pET32c+中，使之与载体上的硫氧还蛋白基因进行框内融合，构建能表达Trx-SjEnolaseepitope,Trx-SjGAPDHepitope和Trx-SjGST28epitope融合蛋白的重组表达质粒Trx-SjEnolaseepitope/pET32c+,Trx-SjGAPDHepitope/pET32c+和Trx-SjGST28epitope/pET32c+。重组质粒分别转化入受体菌大肠杆菌BL21，采用镍离子亲和层析法制备纯化的三种单表位融合蛋白。三)抗日本血吸虫高丰度排泄分泌蛋白表位单克隆抗体的制备与初步鉴定以重组GST-SjMEP融合蛋白免疫BLAB/c小鼠,三次加强免疫后小鼠血清抗体滴度高于1：200，000。制备免疫小鼠的脾单细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，制备杂交瘤细胞。以重组GST-SjMEP融合蛋白为检测抗原，通过间接ELISA检测，获得了205孔能分泌抗GST-SjMEP融合蛋白抗体的杂交瘤细胞。部分细胞亚克隆后进一步用单表位融合蛋白Trx-SjEnolaseepitope,Trx-SjGAPDHepitope和Trx-SjGST28epitope进行筛选，获得8株分泌抗SjEnolaseepitope单克隆抗体的细胞，3株分泌抗SjGAPDHepitope单克隆抗体的细胞，1株分泌抗SjGST28epitope单克隆抗体的细胞。这些单克隆抗体用于建立检测循环抗原血吸虫病诊断方法的应用价值尚需进一步研究。结论本研究成功地构建了日本血吸虫23kDa膜蛋白大亲水肽段（Sj23HD）的酿酒酵母外分泌表达系统，制备了纯化的具有天然结构与免疫活性重组Sj23HD-HSA融合蛋白，初步证实了Sj23HD蛋白在鼠及家兔体内诱导短寿抗体反应，检测参与抗Sj23HD蛋白短寿抗体反应的抗体具有血吸虫病诊断与疗效考核潜能。此外，本研究鉴定到一批日本血吸虫成虫高丰度排泄分泌物蛋白SjEnolase、SjGAPDH和SjGST28的抗原表位。设计和制备由4个抗原表位组成的血吸虫多表位蛋白（SjMEP）,获得了一批抗SjEnolase、SjGAPDH和SjGST28蛋白的单克隆抗体。本研究为进一步发展高效血吸虫病疗效考核方法奠定了基础。
【作者】张伟；
【导师】余传信；
【作者基本信息】江苏省血吸虫病防治研究所，病原生物学，2012，硕士
【关键词】日本血吸虫；Sj23HD；短寿抗体反应；酵母；外分泌表达；排泄分泌蛋白；表位；单克隆抗体；诊断；

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