丝素蛋白纳米纤维和人角质形成细胞在皮肤组织工程中的运用

【摘要】随着对皮肤损伤治疗研究的进展，组织工程皮肤是近年来研究的热点，有着广阔的临床应用前景。皮肤在面临大面积烧伤或损坏时急需获得大量的表皮覆盖以促进皮肤组织的再生与修复。丝素蛋白在兼顾其它生物材料的多种优良特性的同时，更具有多层面可控性的特色，为皮肤组织工程提供了良好的生物材料。人角质形成细胞来源于皮肤最外层的表皮层，表皮细胞的体外培养技术为研究表皮分化机制奠定了厚实的基础。本论文旨在利用丝素蛋白纳米纤维和角质形成细胞在体外构建组织工程皮肤，从而探讨其在皮肤组织损伤修复中的作用。本实验采用从外科手术废弃的幼儿手指皮肤中提取人角质形成细胞，利用丝素蛋白高级结构的可调控性，通过角质形成细胞体外三维培养体系检验丝素蛋白支架材料，进一步分析角质形成细胞与支架材料的相容性及其在皮肤损伤修复中的作用，为进一步的研究和应用奠定基础。第一部分人角质形成细胞的培养和鉴定及其与丝素蛋白纳米纤维膜材料相容性的研究目的：从废弃的幼儿六指皮肤中分离获得角质形成细胞进行体外培养和生物学特性的鉴定，并研究其与丝素蛋白纳米纤维膜材料的相容性。方法：应用中性蛋白酶和胰蛋白酶联合两步消化法从废弃幼儿六指皮肤中提取角质形成细胞，采用人表皮细胞无血清培养基在体外培养和传代。RT-PCR和免疫荧光染色技术鉴定角质形成细胞的标志基因和蛋白质的表达。将角质形成细胞接种在丝素蛋白纳米纤维材料上，培养后取不同时间点在倒置显微镜下观察，并通过扫描电镜检测细胞在材料上的黏附生长以及细胞的增殖。结果：人角质形成细胞呈典型的上皮细胞样生长，排列规律，细胞边界明显，核清晰；RT-PCR检测结果显示，分离培养的细胞表达角质形成细胞标志基因CK5、CK14和β1-intergin，免疫荧光染色结果证实其表达角蛋白CK5和CK14。角质形成细胞接种在丝素蛋白纳米纤维材料后，呈材料引导着细胞的黏附生长和铺展并有效地增殖，可见有胞外基质分泌，由此表明人角质形成细胞能在体外良好地生长，与丝素蛋白纳米纤维材料有较好的相容性。结论：成功建立人角质形成细胞的分离和体外培养体系并对其生物学特性进行鉴定，证明了其与丝素蛋白纳米纤维材料具有良好的相容性，为进一步研究丝素蛋白纳米纤维材料在皮肤组织工程中的应用提供了理论依据。第二部分丝素蛋白纳米纤维材料在表皮层皮肤组织三维气液培养模型中的应用及其在皮肤损伤修复中作用的研究目的：建立表皮层皮肤组织三维气液培养模型，在体外利用丝素蛋白纳米纤维结合人角质形成细胞构建组织工程皮肤，并研究丝素蛋白纳米纤维在皮肤组织损伤修复中的作用。方法：采用鼠尾Ι型胶原建立表皮层皮肤组织三维气液培养模型作为本研究的阳性对照，再以丝素蛋白纳米纤维膜为基质进行三维气液培养，石蜡切片HE染色观察角质形成细胞在体外的分化。将丝素蛋白纳米纤维作为表皮覆盖物移植到裸鼠皮肤损伤处，观察记录创面修复情况并通过对移植区组织切片免疫荧光检测材料在皮肤损伤修复中的作用。结果：以丝素蛋白纳米纤维膜为基质进行三维气液培养后，角质形成细胞发生了分层，当使用厚度更薄（30-60μm）的材料后，细胞呈现更为分化的状态。对裸鼠皮肤损伤修复的实验表明，丝素蛋白纳米纤维膜覆盖的创面修复得更快更好；免疫荧光染色结果检测出角蛋白CK10和CK14的表达，提示表皮层修复完好。结论：丝素蛋白纳米纤维可作为体外构建组织工程皮肤的较理想材料，可将其作为表皮覆盖物应用于皮肤损伤修复。
【作者】丁思思；
【导师】卢斌峰；张学光；
【作者基本信息】苏州大学，免疫学，2014，硕士
【关键词】人角质形成细胞；丝素蛋白纳米纤维；三维气液培养；皮肤组织工程；皮肤损伤修复；

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