外周血CD34~+细胞移植治疗肢体重度缺血的基础与临床研究

【摘要】第一部分人外周血CD34+细胞的体外原代培养鉴定及生物学特性目的：通过梯度密度离心法和免疫磁珠分离法从人体外周血中获取CD34+细胞,在体外原代培养、扩增、鉴定、冻存与复苏,探讨其生物学特性,为患者再次干细胞移植提供可能的干细胞来源。方法：使用梯度密度离心法采集人外周血中单个核细胞,应用免疫磁珠吸附法获取CD34+细胞,在含有生长因子的X-VIVO培养液和高糖DMEM培养液中继续培养扩增。光镜观察细胞形态、生长特性；全自动活细胞观测分析系统(Cell-IQ)动态观察细胞分裂及迁移；免疫荧光技术对其表面标志物CD34及CD133进行鉴定；冻存CD34+细胞1年后复苏观察细胞活性。结果：原代培养的CD34+细胞在X-VIVO培养液中呈悬浮生长,3d细胞集落形成,5d有少量细胞开始贴壁生长,7d纺锤形的细胞数量增多,9d开始出现细胞碎片,此时悬浮细胞与贴壁细胞分开培养,贴壁细胞用高糖DMEM培养,悬浮细胞继续用X-VIVO培养,14d悬浮细胞大部分死亡,贴壁细胞集落形成。Cell-IQ动态观察细胞平均的分裂时间为90分钟,几乎所有的悬浮细胞均向中央移动。免疫荧光鉴定细胞表面标志物CD34(+)和CD133(+)。-80℃冰箱直接冻存,1年后复苏,应用Cryostor冻存液,细胞活力为(89.0+2.58)%,应用DMSO冻存液细胞活力为(84.9±3.28)%,两者有统计学意义。结论：纯化的CD34+细胞在体外培养扩增是可行的,冻存复苏后对细胞的活力影响较小,为患者再次移植提供足够的干细胞来源成为可能。第二部分CD34+细胞移植治疗裸鼠后肢缺血的实验研究目的：观察人外周血CD34+细胞移植治疗裸鼠后肢动脉缺血的效果,并且探讨其可能的机制。方法：裸鼠36只,随机分为CD34组、X-VIVO组和假手术组,每组12只,CD34组、X-VIVO组剥离左侧股动脉至胭动脉水平,制备成裸鼠后肢动脉缺血模型,观察其后肢缺血情况,假手术组不剥离血管,其余同前两组。饲养1周后CD34组裸鼠给予含有CD34+细胞(1×105cells)的X-VIVO培养液0.1ml注射于患肢缺血肌肉组织中,X-VIVO组裸鼠注射不含CD34+细胞的X-VIVO培养液0.1ml,假手术组仅注射生理盐水0.1m1,饲养2周后取裸鼠内收肌和半膜肌标本,抗CD31和抗CD34免疫组织化学染色,显示血管内皮细胞、血管密度；RealTime-PCR检测组织中VEGF和bFGFmRNA的表达情况；结果：免疫组化染色显示CD34组微血管密度较X-VIVO组和假手术组明显增加。RT-PCR检查显示CD34组VEGF和bFGFmRNA表达最强,其次是X-VIVO组(P<0.05),假手术组则最低(P<0.05)。结论：应用CD34+细胞移植可以明显促进血管新生、侧枝血管形成进而增加下肢缺血组织的血流灌注。第三部分纯化自体外周血CD34+细胞移植治疗肢体重度缺血的临床研究目的：研究临床应用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后经外周血采集单个核细胞(PB-MNC),免疫磁珠分选仪提取纯化CD34+细胞移植治疗肢体重度缺血的安全性,可行性和有效性。方法：自2009年5月至2011年7月,入组患者共25例,其中治疗下肢25条和上肢3条,平均年龄44±12岁,均不具备外科血管重建条件。G-CSF(5-10μg/kg)动员第5天采集外周血单个核细胞,分选获得纯化CD34+细胞,肢体肌肉局部注射,所有病例分为3组：低剂量组(105/kg)、中剂量组(5×105/kg)和高剂量组(106/kg)。观察不良反应和缺血缓解情况。结果：随访6-33个月,1个月和2个月时Wong-BakerFACES疼痛评分由术前7±2分别下降到3±3(P=0.0000)和1±2(P=0.0000)；3个月和6个月时,平板试验无疼痛步行时间从术前4±3min上升到13±7min(P=0.0005)和18±6min(P=0.0000)；踝肱指数从术前0.46±0.21上升到0.60±0.17(P=0.003)和0.67±0.15(P=0.001)；经皮氧分压由27±10mmHg升至41±11mmHg(P=0.0001)和55±12mmHg(P=0.0000);14例溃疡患者愈合10例,4例在3个月内行截肢术；KaplanMeier生存分析法计算6个月保肢率为84%(95%可信区间为0.63～0.94)。比较3组(低剂量组5例;中剂量组11例;高剂量组9例),1个月时Wong-BakerFACES疼痛评分高剂量组(6.3±1.7)较低剂量(3.2±3.3,P=0.0487)和中等剂量组(3.7±2.8,P=0.0352)明显改善,其余没有发现显著差异。结论：经G-CSF动员采集PB-MNC提取纯化CD34+细胞移植治疗肢体重度缺血性疾病是可行、安全和有效的。
【作者】廉维帅；
【导师】符伟国；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】CD34；干细胞；原代细胞培养；细胞活力；cell-IQ；血管发生；免疫组化；下肢缺血模型；移植；重度肢体缺血；G-CSF；

【参考文献】
[1]闻红利.C2C电子商务网站信用评价研究[D].浙江工业大学,2013.
[2]郭晓飞.基于SCADE的核反应堆保护系统嵌入式软件设计[D].西安电子科技大学,计算机技术,2011,硕士.
[3]刘蓉.数据挖掘及其在通信企业经营分析领域的应用[J].科技进步与对策,2004,10:159-161.
[4]皮振新.发动机薄壁零件疲劳寿命预测研究[D].河南科技大学,动力机械及工程,2013,硕士.
[5]杨国荣.图像处理中的演化方法[D].贵州民族大学,概率论与数理统计,2012,硕士.
[6]陈涛.逆向工程中数据分块和规则曲面拟合算法的研究[D].南京航空航天大学,机械电子工程,2004,硕士.
[7]赵卫山.夏热冬暖地区居住建筑节能全过程管理的研究[D].华南理工大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2012,硕士.
[8]蒋纪委.基于智能算法的气体辅助注塑成型工艺参数优化的研究[D].吉林大学,机械工程,2014,硕士.
[9]王福军.高速轻载工况下浮环轴承油膜压力场数值仿真分析[D].重庆大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[10]刘晓英.医疗内窥镜图像病变区域自动识别算法的设计与实现[D].湖南大学,电子科学与技术,2012,硕士.
[11]王鹏,陈森.基于平行控制的信息安全管理措施仿真与优化[J].自动化学报,2011,11:1351-1355.
[12]郭晨.全球价值链下中国汽车零部件产业升级影响因素研究[D].武汉理工大学,国际贸易学,2012,硕士.
[13]朱怡天.《浮生六记》林语堂英译本中文化负载词的翻译[D].上海外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[14]王晓峰.高中立体几何解题教学研究[D].内蒙古师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[15]韩嘉.医院物流绩效管理体系研究[D].西南交通大学,物流工程,2014,硕士.
[16]李显鹏.面向模具生产制造过程的知识整合研究[D].广东工业大学,工业工程,2013,硕士.
[17]张冬冬.用于LTE的混合基DFT算法的FPGA实现[D].西安电子科技大学,软件工程,2012,硕士.
[18]陈水英.基于原型理论的英语名词可数性的研究[D].湖南科技大学,英语语言文学,2013,硕士.
[19]朱凌志,陈宁,王伟.兼顾接入地区无功需求的风电场无功控制策略[J].电力系统自动化,2009,05:80-85.
[20]江炜昌.基于RFID的毛织品生产管理系统设计[D].华侨大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[21]刘潮汛.房地产网站新闻内容研究[D].黑龙江大学,传播学,2013,硕士.
[22]李福军.基于智能计算的油气储集层损害诊断决策支持系统[D].哈尔滨工程大学,2005.
[23]高福祥.强化贯标进一步促进电气设备的使用安全[J].组合机床与自动化加工技术.1992(12)
[24]于宏超.热风炉热工过程模拟及特性分析[D].东北大学,热能工程,2011,硕士.
[25]袁建平.基于精益生产的南岳公司总装生产管理改进策略研究[D].湖南大学,工商管理,2013,硕士.
[26]牛鑫.多媒体时代电影多元化生存[D].中国艺术研究院,广播电视艺术学,2014,硕士.
[27]葛付涛.PKP中采用液态人工骨或骨水泥填充治疗胸腰椎骨折的疗效对比研究[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[28]李宣.用正交函数和复积分计算超奇异积分[D].燕山大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[29]于少冲.具有采样抖动的线性网络化控制系统的控制算法设计[D].燕山大学,系统工程,2014,硕士.
[30]项忠彪.基于顾客满意度的创新产品动态管理机制研究[D].浙江大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[31]荣婷婷.大学生情绪智力、自我和谐与主观幸福感的关系[D].济南大学,发展与教育心理学,2012,硕士.
[32]仲海燕.清代镇番县志研究[D].青海师范大学,中国古典文献学,2012,硕士.
[33]袁术斌.三萜、多糖高产灵芝菌株育种及生物特性测定[D].南京农业大学,生物工程,2013,硕士.
[34]赵俊.西安、咸阳公示语汉英翻译研究[D].西安电子科技大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[35]田素馨.二型糖尿病患者血糖值稳定影响因素探讨[D].吉林大学,营养与食品卫生学,2012,硕士.
[36]杨兔艳.图像实时滤波方法及其FPGA实现[D].杭州电子科技大学,计算机技术,2012,硕士.
[37]董燕红.Ag85A-MPB63融合蛋白在牛结核病ELISA诊断中的应用[D].吉林农业大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[38]周杰.信息处理与融合中递推算法研究[D].四川大学,2003.
[39]郑磊.文档统一管理平台的设计与实现[D].北京交通大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[40]储昭将.我国养老保险制度研究[D].南京大学,社会保障（专业学位）,2013,硕士.
[41]陆涛,陶曙明,张范斌,戴志刚,徐兴原,温治.均热炉群钢锭烧好动态预报计算机优化控制系统及其应用[J].冶金自动化,2005,06:23-27+45.
[42]陈蕾.湖南溆浦地区传统民居地域特点研究[D].湖南大学,建筑学,2011,硕士.
[43]黄玉彬.变频器在轧钢辊道上的应用[J].冶金自动化,1999,02:52-53.
[44]郭志高,高晓光,邸若海.小数据集条件下基于双重约束的BN参数学习[J].自动化学报,2014,07:1509-1516.
[45]袁毅.CNKI运作模式及其对ICP经营及产业化发展的启示[J].现代情报,2003,03:61-63.
[46]常大鹏.商誉与商誉会计[D].武汉理工大学,会计学,2004,硕士.
[47]李孝君.金融机构市场退出研究[D].首都经济贸易大学,金融学,2004,硕士.
[48]林世芳.论信息化与我国的政治文明建设[D].福建师范大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[49]赵瑞珍.黄连温胆汤对大鼠慢性胃炎的病理及bcl-2、bax蛋白表达影响的实验研究[D].成都中医药大学,中医内科学,2012,硕士.
[50]刘文.基于XBRL的通用分类标准扩展的公司信息披露实务研究[D].哈尔滨工业大学,会计学,2014,硕士.