HMGB1对膀胱癌侵袭性增殖的影响和机制研究

【摘要】背景：膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,主要为泌尿上皮癌。目前临床上迫切需要寻找一种敏感且有效的分子诊断标记,预警高侵袭潜能的膀胱癌,实施及时干预的治疗方案。高迁移率族蛋白B(high-mobilitygroupbox,HMGB)包括HMGB1和HMGB2,作为非组蛋白核蛋白具有稳定细胞核、协助基因转录及调节甾体受体活性以及促进DNA修复等作用。研究发现HMGB1和HMGB2在一些肿瘤中特异性过表达,还可能与肿瘤的发生、增殖分化、血管生成以及化疗耐药等密切相关,但在膀胱癌发生发展、血管生成和转移机制等方面尚不清楚,值得进一步研究。目的：研究HMGB在膀胱癌中的表达,分析其与肿瘤发生发展和血管生成之间的关系；在细胞实验和动物实验中,采用RNA干扰(RNAinterfering,RNAi)技术靶向抑制HMGB1基因,研究其对人膀胱癌细胞侵袭性增殖的影响,初步探索其可能的下游作用机制,为其在临床和基因治疗中的应用提供相应的实验基础。方法：(1)收集64例膀胱癌手术组织标本,15例正常膀胱组织标本,采用实时荧光定量PCR(Real-timefluorescentquantitativePCR,Real-timePCR)口免疫组化方法检测人膀胱癌组织中HMGB1和HMGB2基因mRNA和蛋白表达情况,分析它们与肿瘤临床分期和病理分级的关系,并分析HMGB1和HMGB2表达与血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)和微血管密度(microvesseldensity,MVD)之间的关系,研究HMGB1和HMGB2在膀胱癌血管生成的作用和地位,并确定在膀胱癌中的优势表达分子。(2)采用RNAi技术靶向抑制5637人膀胱癌细胞HMGB1基因,应用Real-timePCR和Western-blot检测未感染组(Con组)、阴性对照感染组(sh-Con组)以及shHMGB1感染组(sh-HMGB1组)细胞的HMGB1基因表达情况；流式细胞仪分析各组细胞周期的变化；MTT实验、BrdU惨入实验、克隆形成实验评估各组细胞增殖和生长能力；Transwell实验评估各组细胞的迁移和侵袭能力。(3)将5637人膀胱癌细胞接种于裸鼠,进行定点注射sh-HMGB1慢病毒的抑瘤实验,评估使用慢病毒靶向抑制HMGB1基因表达对膀胱癌细胞成瘤能力的影响,为其临床应用和肿瘤基因治疗提供相关的实验基础；其次,使用Western-blot方法检测各组5637人膀胱癌细胞中NF-KB/p65和VEGF-C蛋白的表达水平,酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)方法检测NF-KB/p65活性对VEGF-C含量的影响,初步研究RNAiHMGB1基因后其下游相关信号通路NF-κB/P65-VEGF-C的变化情况。结果：(1)免疫组化结果表明在64例膀胱癌肿瘤标本中有35例(55%)标本HMGB1的表达为高表达,19例(30%)膀胱癌标本HMGB2的表达为高表达；Real-timePCR和免疫组化结果表明膀胱癌组织中HMGB1和HMGB2基因mRNA和蛋白的表达与肿瘤的临床分期和病理分级相关,与VEGF的表达和MVD相关,有显著的统计学差异(p<0.05)。(2)HMGB1-shRNA慢病毒感染5637人膀胱癌细胞后,sh-HMGB1组细胞的HMGB1mRNA表达相对含量(0.25±0.04)以及蛋白表达较Con组和sh-Con组显著下降(p<0.05);sh-HMGB1组G0/G1期细胞比例(63.44±1.17%)较Con组53.91±1.09%和sh-Con组51.13±1.33%明显升高(p<0.05);MTT和BrdU实验表明sh-HMGB1组细胞存活数量和DNA合成较Con组和sh-Con组显著降低(p<0.05)；克隆形成实验中sh-HMGB1组克隆数量为51.00±13.11个,较Con组和sh-Con组显著减少(p<0.05);Transwell实验表明sh-HMGB1组到达下室的细胞数为54.00±28.68个,明显少于Con组的96.00±36.51个和sh-Con组的104.33±28.69个(p<0.05)。(3)定点注射sh-HMGB1慢病毒的裸鼠抑瘤实验表明LV-HMGB1组肿瘤体积(285.90±86.15mm3)和重量(0.26±0.11g)比NS组和LV-Con组显著减少(p<0.05);Western-blot检测表明sh-HMGB1组细胞中的NF-KB/p65和VEGF-C蛋白相对表达量分别为0.452±0.005和0.467±0.006明显低于Con组和sh-Con组,有统计学差异(p<0.05)；ELISA检测发现sh-HMGB1组上清液中的VEGF-C含量为211.58±8.16pg/ml明显低于Con组和sh-Con组(P<0.05);NF-κB抑制剂可以显著降低VEGF-C含量,HMGB1作为NF-κB激动剂进行回复实验,可以显著升高VEGF-C含量(p<0.05)。结论：(1)HMGB1和HMGB2在膀胱癌组织中特异性过表达,与肿瘤的临床分期和病理分级相关,并且HMGB1和HMGB2与VEGF表达和MVD计数相关,提示HMGB1和HMGB2在膀胱癌的发生发展和血管生成中起着重要的调节作用,HMGB1的表达和作用占有相对的优势。(2)采用RNAi技术可以显著抑制膀胱癌细胞中HMGB1基因和蛋白的表达,并且HMGB1基因沉默后膀胱癌细胞的生长、增殖、迁移和侵袭能力等均受到显著抑制,提示HMGB1基因在膀胱癌发生发展及转移过程中具有重要作用。(3)定点注射sh-HMGB1慢病毒可以显著抑制膀胱癌细胞种植于裸鼠后的生长和成瘤能力；HMGB1可以通过NF-κB信号通路调节VEGF-C的表达。总之,本研究为探索靶向抑制HMGB1基因在膀胱癌临床和肿瘤基因治疗中的应用提供了实验基础,HMGB1可能成为新的治疗膀胱癌的靶点。
【作者】汪伟；
【导师】丁强；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】高迁移率族蛋白B；膀胱癌；RNA干扰；血管生成；增殖；

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