下丘脑室旁核P2X_7受体对大鼠急性心肌梗死损伤的调控作用及其分子机制研究

【摘要】研究背景：心血管疾病关乎人类健康与生活质量,急性心肌梗死是常见的心血管疾病,其发病率与致死率逐年上升。如何找到预防与治疗急性心肌梗死损伤的药物作用靶点及开发治疗心肌梗死的相关药物成为国内外研究的热点。该疾病的中枢发病机制与治疗策略的研究主要集中于中枢心血管调节区,如下丘脑室旁核(hypothalamicparaventricularnuclei,PVN)与延髓头端腹外侧区(rostralventrolateralmedulla,RVLM),其主要通过炎症、氧化应激等相关信号通路对急性心肌梗死损伤起调控作用,调节机制错综复杂,尚存诸多未解之谜。新近的研究发现,P2X7受体能够促进炎症反应、致炎细胞因子合成与释放,那么中枢PVN内炎症反应是否参与对急性心肌梗死的调控呢?如果参与,是否与P2X7受体有关呢?如果有关,P2X7受体又是如何调控炎症细胞因子产生的呢?P2X7受体是通过何种途径参与炎症因子的产生并影响外周交感神经活动进而发挥其对心肌梗死损伤调控作用的呢?目前,所有有关中枢PVN区P2X7受体调节心血管活动的分子机制仍不清楚。目的：本课题以大鼠急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)损伤模型为研究对象,研究下丘脑室旁核小胶质细胞P2X7受体通过影响外周交感神经活动进而调节大鼠急性心肌梗死损伤。从形态学与分子生物学角度,观察AMI组与Sham组大鼠下丘脑室旁核P2X7受体蛋白的表达。从功能学角度,观察AMI组与AMI+si-P2X7组大鼠外周交感神经活动与心功能的改变,来证实中枢PVN通过P2X7受体参与对大鼠AMI损伤的调节。再者,从形态学与分子生物学角度,观察AMI组与AMI+si-P2X7组中枢PVN区催产素(Oxytocin,OT)与血管升压素(Vasopressin,AP)的表达,进一步判断P2X7受体通过脑内哪类神经元参与对大鼠AMI的调控?最后,从分子生物学与形态学角度,观察中枢PVN内促炎细胞因子(interleukin1β,IL-1β和tumornecrosisfactor-α,TNF-α)表达及促炎细胞因子上游调控蛋白caspase-1与P65-NF-κB的表达,更深一步研究P2X7受体通过相关分子信号转导通路调控大鼠急性心肌梗死损伤。方法：采用结扎冠状动脉左前降支的方法制备大鼠AMI模型,并同时监测大鼠平均动脉压(MAP),心率(HR),心室内压(IVP)与左室舒张末期压(LVEDP)。采用氯化四唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,TTC)染色检测大鼠急性心肌梗死造模是否成功,苏木精和伊红(HE)染色观察不同心肌缺血时间点心肌组织病理学改变。采用激光共聚焦结合免疫荧光双标技术,观察中枢PVN内小胶质细胞标志蛋白Iba-1与P2X7受体蛋白共表达情况；采用蛋白免疫印迹法(westernblot)检测各组大鼠(Sham组、AMI组、AMI组+si-RNA组、AMI组+BBG组)PVN内P2X7、IL-1β与TNF-α蛋白表达的变化;同时应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定各组大鼠PVN核团组织中IL-1β与TNF-α的含量；与此同时,通过生物信息采集系统观察各实验组大鼠心肌缺血后血流动力学、外周交感神经活动及心脏自主神经变化,并应用心率变异性(HRV)分析系统分析大鼠心脏自主神经功能状态。采用免疫组织化学(IHC)方法检测AMI组与AMI+siRNA组大鼠PVN内催产素与血管升压素的表达,明确P2X7受体经释放炎症因子激活或敏化中枢内哪类神经元；采用免疫组织化学(IHC)方法检测AMI组与AMI+siRNA组大鼠PVN内炎症细胞因子上游调控蛋白Caspase-1与P65-NF-κB的表达。结果：(1)大鼠AMI模型的制备：结扎大鼠冠状动脉左前降支,大鼠立即出现心电图S-T段抬高,结扎线远端心肌发白,收缩力降低,运动减弱。TTC染色显示：心肌缺血区域发白；HE染色结果显示：随着缺血时间的延长,心肌梗死程度越严重并伴有心肌纤维溢出；这些结果证实了大鼠AMI模型制备成功。(2)激光共聚焦免疫荧光双标结果显示：P2X7受体蛋白在大鼠PVN区与小胶质细胞标志性蛋白Iba-1有共表达,且主要集中于PVN区域,80%集中表达在小胶质细胞胞膜、胞质而在胞核内无表达。(3)生物发光测定结果显示：与Sham组相比,AMI大鼠PVN内神经递质ATP释放量迅速增加(P<0.05,n=6)且呈时间依赖关系；在心肌缺血4h时间点ATP的释放量达最高点,心肌缺血8h后ATP含量逐渐降低。(4)RT-PCR和Westernblot结果显示：P2X7R蛋白在各组大鼠PVN中均有表达,与Sham组相比,AMI组表达量明显升高(P<0.05,n=6)且呈时间依赖关系,心肌缺血后4h达最高峰；与AMI组相比,AMI+P2X7R-siRNA组与AMI+BBG组大鼠PVN内P2X7R、IL-1β与TNF-α蛋白与mRNA表达量均明显下降(P<0.05,n=6)。(5)ELISA检测方法显示：与Sham组相比,AMI大鼠PVN内IL-1β与TNF-α浓度增高(P<0.05,n=6)；事先PVN内给予P2X7R-siRNA或腹腔给予BBG能明显降低IL-1p与TNF-α浓度(P<0.05,n=6)。(6)免疫组织化学结果显示：与Sham组相比,AMI大鼠PVN区OT能阳性神经元与VP能阳性神经元数目增多(P<0.05,n=6),PVN内微量注射P2X7R-siRNA后OT与VP能免疫阳性神经元数目与AMI组相比明显降低(P<0.05,n=6)。与Sham组相比,AMI大鼠PVN区Caspase-1与P65-NF-KB表达量增多(P<0.05,n=6)；与AMI组相比,PVN内微量注射P2X7R-siRNA后Caspase-1表达量明显减少(P<0.05,n=6)；然而,PVN内微量注射P2X7R-siRNA后P65-NF-KB表达量与AMI组相比,无明显变化(P>0.05,n=6)。(7)血流动力学与心肌力学检测结果显示：与AMI组大鼠相比,预先PVN内微量注射P2X7R-siRNA或腹腔内预先给予P2X7受体阻断剂BBG能使AMI大鼠(AMI+siRNA组、AMI+BBG组)MAP、HR、IVP、LVEDP与HRV(LF/HF)各项指标均降低(P<0.05,n=6)。(8)外周肾交感神经活动(RSNA)记录结果显示：与Sham组大鼠相比,AMI组大鼠RSNA增强(P<0.05,n=6)；预先PVN内微量注射P2X7R-siRNA或腹腔内预先给予BBG能使AMI组大鼠RSNA减弱(P<0.05,n=6)。结论：(1)结扎大鼠冠状动脉左前降支制备急性心肌梗死模型,致使外周交感神经活动增强,同时致AMI大鼠下丘脑PVN内P2X7受体蛋白高表达,可能与心传入反射有关；与此同时,高表达的P2X7受体增强外周交感神经活动,进一步加剧急性心肌梗死损伤。如此的反馈机制形成一个恶性循环过程,促使大鼠AMI损伤进一步恶化。(2)PVN内预先微量注射P2X7R-siRNA或腹腔内预先给予BBG,可以降低PVN内IL-1p与TNF-α的表达,同时减少了OT与VP能神经元的数目,降低了外周RSNA。PVN内P2X7R对大鼠AMI损伤的调控可能与其释放炎症细胞因子IL-1β与TNF-α,进而通过PVN区OT与VP能神经元纤维投射调控外周RSNA。(3)炎症细胞因子IL-1p在PVN内的形成机制可能与其上游调控蛋白Caspase-1及P65-NF-κB的表达增多有关。炎性因子释放量增多促PVN区OT与VP能神经元敏化,进一步调控RSNA,影响心功能。
【作者】杜东书；
【导师】朱大年；
【作者基本信息】复旦大学，生理学，2013，博士
【关键词】大鼠；急性心肌梗死；室旁核；P2X7受体；炎症细胞因子；OT能神经元；VP能神经元；肾交感神经活动；

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