肝细胞癌患者外周血及癌组织中CD4~+Foxp3~+调节性T淋巴细胞增多的相关机制研究

【摘要】调节性T淋巴细胞(regulatoryTcell,Treg)是一类具有免疫抑制作用的淋巴细胞亚群,占正常人外周血中CD4+T淋巴细胞亚群的5-10%。Treg细胞最早由日本科学家Sakaguchi于1995年首先报道,并且迅速成为免疫学研究的热点之一。Treg细胞的主要表面标志物为CD4、D25,而胞核标志物为Foxp3。Foxp3对于Treg细胞的分化、发育以及发挥免疫抑制功能具有重要作用。自Treg细胞被发现之后多种自身免疫系统疾病如类风关(rheumatoidarthritis,RA)、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)、多发性硬化(multiplesclerosis,MS)等都被认为与该群细胞功能受损或者数量减少有关。而正是由于Treg细胞所特有的负免疫调节作用也吸引了越来越多研究者的目光。近年来的研究表明肿瘤组织当中Treg细胞含量的高低与肿瘤患者的愈后密切相关,特别是在肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)患者当中Treg细胞含量越高者其愈后往往越差。而动物实验以及一些Ⅱ期临床实验表明特异性的清除Treg细胞可以明显抑制肿瘤生长甚至是使肿瘤完全消退。这表明Treg细胞所介导的免疫抑制作用有可能是导致癌细胞成功逃避机体免疫监视进而发生远处转移的重要原因之一。因此本研究的目的在于明确HCC诱导Treg细胞生成的分子机制并进一步探讨其在HCC治疗过程当中的潜在价值。本论文分成三部分加以讨论。第一部分肝细胞癌患者外周血及癌组织中CD4+Foxp3+调节性T淋巴细胞的含量与预后的关系我们首先使用流式细胞技术对HCC患者外周血中CD4+Foxp3+Treg细胞含量进行检测,并同慢性乙肝后肝硬化患者及正常人外周血中的Treg细胞进行对比。通过对比我们发现HCC患者及慢性乙肝后肝硬化患者外周血中CD4+Foxp3+Treg细胞含量较正常人均明显增加,但HCC患者与慢性乙肝后肝硬化患者外周血中Treg细胞含量并无明显差异。接下来我们使用免疫组化技术对151例HCC患者手术切除标本进行染色,通过免疫组化我们发现绝大部分Foxp3+细胞位于癌组织边缘,仅有少部分阳性细胞发现于癌旁及癌组织中心部位。根据癌组织当中阳性细胞的个数由低到高将151例手术患者进行排列,取中位数将该队列分为低表达组(75例)和高表达组(76例)。随后使用Cox风险比例模型对HCC患者术后总生存期(overallsurvival,OS)和无瘤生存期(diseasefreesurvival,DFS)相关危险因素进行单因素和多因素方差分析。结果显示,除肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤包膜等因素与患者的生存和肿瘤复发相关外,癌组织中Foxp3+细胞数目也是患者预后的独立危险因素。这一部分研究提示,癌组织中Treg细胞数目的多少是预测HCC患者预后的重要标志物。因此明确HCC诱导Treg细胞生成的相关分子机制有可能为HCC的治疗提供潜在的治疗靶点。第二部分肝癌细胞分泌TGF-β1诱导外周血及癌组织中CD4+CD25-T淋巴细胞向调节性T淋巴细胞转化的相关机制研究在前一部分中我们发现HCC和Treg细胞关系密切,并且高表达Treg细胞的HCC患者其预后较差,在本节中我们主要探讨肝细胞癌如何诱导Treg细胞产生。前人的研究表明TGF-β1是诱导幼稚CD4+T细胞向Treg细胞转化的重要细胞因子,通过免疫荧光和免疫组化我们发现肝癌细胞具有分泌TGF-β1的功能,这表明肿瘤有可能通过分泌TGF-β1来诱导外周血及癌组织中的幼稚CD4+T细胞向Treg细胞转化。接下来我们使用磁珠将小鼠脾脏和淋巴结中的CD4+CD25-细胞分离并使用小鼠肝细胞癌Hepal-6培养上清在抗CD3/CD28beads的刺激下体外培养3天后通过流式细胞仪、Westernblot和real-timePCR来检测其中Foxp3表达情况,发现在加入HCC细胞培养上清液后4.66%的CD4+T细胞表达Foxp3而对照组只有1.69%细胞表达。为证明HCC细胞分泌的TGF-β1是诱导Treg细胞产生的主要因子,我们首先使用慢病毒转染技术建立了TGF-β1knockdownHepal-6(shRNA-TGF-β1-Hepal-6)稳转细胞并收集上清液,同时使用TGF-βreceptorI磷酸化酶抑制剂及recombinantTGF-β1分别培养磁珠分选的CD4+CD25-T细胞。结果表明在使用了shRNA-TGF-β1-Hepal-6细胞的培养上清液和TGF-βreceptorI磷酸化酶抑制剂后肿瘤上清诱导CD4+CD25″T细胞向Treg细胞转化的功能受到显著抑制,而在TGF-β1knockdown细胞的培养上清液加入重组的TGF-β1则可以显著的增加CD4+CD25-细胞向Treg细胞转化的能力。我们还同时发现肿瘤细胞培养上清液对Treg细胞的诱导作用具有时间依赖性,其在3天时诱导的Treg细胞比例最高。上述结果表明肿瘤细胞分泌的TGF-β1是诱导幼稚CD4+T细胞向Treg细胞转化的重要细胞因子。接下来我们将Hepal-6,scramble和shRNA-TGF-β1-Hepal-6细胞分别接种于小鼠肩胛部位,2周后处死小鼠并取出肿瘤制成蜡块,切片后免疫组化检测其中Foxp3+细胞数,发现在shRNA-TGF-β1-Hepal-6组肿瘤内Treg细胞数目明显减少。我们同时使用上述三株细胞进行小鼠尾静脉注射4周后处死小鼠检测其脾脏中Treg细胞数目,与上述结果类似shRNA-TGF-β1-Hepal-6组小鼠脾脏中的Treg细胞数目明显减少。在本节中我们通过体内外实验详细阐述了肝细胞癌通过分泌TGF-β1诱导CD4+CD25-T细胞向Treg细胞转化的具体机制,为破解HCC如何逃避机体免疫监控提供了详实的证据。第三部分肝细胞癌分泌的TGF-β1l对淋巴细胞功能和癌细胞自身增殖能力的影响及相关机制的探讨和对照组相比recombinantTGF-β11和Hepal-6细胞培养上清能够显著抑制CD8+T细胞分泌IFN-γ并且能够抑制DCs细胞成熟,而在kncokdownTGF-β1后上述抑制效应明显减弱。通过构建shRNA-TGF-β1-Hepal-6细胞株我们发现在knockdownTGF-β1基因后Hepal-6细胞增殖速度明显减慢,这表明HCC细胞分泌的TGF-β1不仅对癌组织中的淋巴细胞产生影响,同时还会对癌细胞自身的增殖发挥作用。为了探讨HCC细胞分泌的TGF-β1对癌细胞自身的影响,我们首先进行平板克隆实验,实验发现在使用TGF-βreceptorI磷酸化酶抑制剂以后肝癌细胞形成克隆的能力明显增强,这表HCC细胞分泌的TGF-β1对自身的增殖具有抑制作用,而在knockdownTGF-β1后Hepal-6细胞形成克隆的能力显著下降,这表明TGF-β1不但具有抑制细胞增殖的作用,还可以促进细胞增殖。通过流式检测我们发现在阻断TGF-βreceptorI介导的下游信号通路以后G1期细胞减少而S期细胞增多,而在knockdownTGF-β1后G1期细胞增多S期细胞减少,并且knockdownTGF-β1引起Hepal-6细胞早期凋亡增加。这表明TGF-β1有可能通过控制细胞周期来达到调控细胞增殖的目的。接下来我们利用Westernblot检测了与细胞周期相关的一些蛋白如c-myc、cyclinD3、CDK4等,结果发现在使用TGF-βreceptorI磷酸化酶抑制剂后除CDK4外上述调控细胞周期的相关蛋白显著增加,而敲除TGF-β1基因后其含量则明显下降,这表明肝癌细胞可以通过分泌TGF-β1调节其自身的增殖速度。接着通过动物实验我们发现在knockdownTGF-β1后Hepal-6的成瘤能力明显减弱,小鼠的生存时间显著延长。上述实验表明肝癌细胞分泌的TGF-β1不仅抑制淋巴细胞的功能对HCC细胞本身具有双重作用,抑制TGF-β1的分泌有可能为肝癌治疗提供新的靶点。综上所述,肝细胞癌能够通过分泌TGF-β1诱导CD4+CD25-淋巴细胞向具有负免疫调节作用的Treg细胞转换,而Treg细胞反应了患者体内的免疫抑制状态,癌组织内过高的Treg细胞是患者预后较差的独立危险因素。另一方面,HCC细胞分泌的TGF-β1不仅抑制淋巴细胞功能以逃避机体免疫监视能力还对癌细胞自身具有双重作用,在抑制细胞增殖的同时还具有促进细胞由G1期向S期转化的作用。TGF-β1作为HCC治疗的潜在靶点具有重要意义。
【作者】王轶；
【导师】沈锡中；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】肝细胞癌；Treg；TGF-β1；预后；总生存期；无瘤生存期；细胞周期；

【参考文献】
[1]颜芬.劳动合同中的竞业限制条款研究[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[2]孙美成.维生素C对黏杆菌素致DRG神经元细胞毒性的颉颃作用[D].东北农业大学,基础兽医学,2013,硕士.
[3]丁海娣.安庆市城乡小学体育现状调查与对策研究[D].南京师范大学,体育人文社会学,2012,硕士.
[4]方赫.Ti-22Al-24Nb合金超塑性能及SPF/DB工艺研究[D].哈尔滨工业大学,材料工程,2013,硕士.
[5]王乐.氧化石墨烯修饰电极在生物电分析中的应用[D].郑州大学,2012.
[6]赵振宁.电动客车控制器设计及控制策略研究[D].哈尔滨理工大学,车辆工程,2013,硕士.
[7]肖志勇.基于可变形部件模型融合上下文的物体类检测[D].吉林大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[8]陆谱进.HIFU治疗监控图像处理算法研究及系统实现[D].湖南师范大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[9]葛存根.《三十六计》的整体特征、系统结构以及谋略思维研究[D].苏州大学,应用心理学,2003,硕士.
[10]赵纪元.数据挖掘在CRM中的应用[N].人民邮电,2001-09-12006.
[11]章琴.欧美企业合并规则的冲突与合作[D].华东政法学院,法律,2003,硕士.
[12]刘亚.PDGF-BB和TGF-β_1联合应用对大鼠正畸牙移动的影响[D].山西医科大学,口腔临床医学,2013,硕士.
[13]张雷.可穿戴式康复腿控制和仿真研究[D].吉林大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[14]李程程.唐宋时期衣领发展与演变的对比研究[D].陕西科技大学,设计艺术学,2013,硕士.
[15]李亚娟.基于访问控制策略的网上评卷系统权限管理[D].内蒙古大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[16]张宵苹.企业社会资本、知识整合能力与知识转移绩效关系研究[D].西安工程大学,企业管理,2013,硕士.
[17]陈炯军.当前地方财政收入可持续增长的对策研究[D].吉林大学,公共管理,2012,硕士.
[18]陈阳.圆织立体碳纤维复合材料三角架的强度分析[D].东华大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[19]付泽伟.万事利集团丝绸文化品牌战略研究[D].兰州理工大学,工商管理,2013,硕士.
[20]沈丽.高精度永磁直线伺服电机法向力波动分析与抑制方法研究[D].沈阳工业大学,电力电子与电力传动,2014,博士.
[21]张阳.叶片加工过程中轮廓控制图方法研究[D].天津大学,工业工程,2010,硕士.
[22]马萍.宁夏电力投资集团有限公司企业文化建设存在的问题及对策[D].宁夏大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[23]李佳.基于流程智能的宇通公司业务流程分析系统构建[D].复旦大学,软件工程,2012,硕士.
[24]王晓瑜,郭吉兆,夏巧玲,丁丽,谢复炜,张晓兵,刘惠民.石墨烯涂层固相微萃取-GC/MS法测定卷烟主流烟气中16种多环芳烃[A].中国烟草学会.CORESTA2014年大会入选论文集[C].中国烟草学会:,2014:14.
[25]洪波,应鑫迪,谢宇威,方伟杰.基于Exmobi高校移动应用平台的研究与实现[J].电脑知识与技术,2014,31:7537-7539.
[26]费光彦.视频车辆监控系统防抖动区域自动搜索及滤波方法的研究[D].郑州大学,测试计量技术及仪器,2013,硕士.
[27]高其烈.中国压缩机标准评介[J].压缩机技术.1988(03)
[28]胡宗棠.基于Cortex-MO+内核Kinetis无线射频模块的应用研究[D].苏州大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[29]王晓霞.T细胞淋巴瘤中Notch1基因突变及其蛋白表达的研究[D].青岛大学,内科学,2013,硕士.
[30]武振.云南省职业教育发展的财政政策及政策效应研究[D].云南财经大学,财政学,2013,硕士.
[31]刘强.YKL-40和VEGF在尖锐湿疣组织中的表达[D].第二军医大学,皮肤病与性病学（专业学位）,2013,硕士.
[32]记者瞿剑.“只要给我数据，就能找出非典规律”[N].科技日报,2003/05/07.
[33]赵敏.《俄罗斯滨海边疆区2025年前的社会经济发展战略》俄译汉的语言特点及翻译方法[D].黑龙江大学,翻译,2013,硕士.
[34]刘众.双梁桥式起重机起升机构动力学仿真研究[D].中南林业科技大学,森林工程,2014,硕士.
[35]王晓楠.剪式升降机的优化设计与试验研究[D].燕山大学,机械工程,2014,硕士.
[36]林品.从网众亚文化到共用能指[D].北京大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[37]胡应宏,任佳佳,王建赜,纪延超.级联STATCOM阀组直流侧电压不平衡现象及原因分析[J].电力系统自动化,2011,21:96-100.
[38]石广钦.EVA/PPC共混多级形状记忆性能研究[D].郑州大学,材料学,2013,硕士.
[39]周斌.体育社团在江苏高职院校中的现状及其对学生身心发展作用的研究[D].苏州大学,体育教育训练学（专业学位）,2014,硕士.
[40]宋莉.煤矿井下综合自动化系统的研究与实现[D].辽宁工程技术大学,电力电子与电力传动,2012,硕士.
[41]王英辉.基于通用CFD的地铁车站热环境模拟系统的开发与应用[D].天津大学,供热、供燃气及通风与空调工程,2004,硕士.
[42]黄宋斌.基于Rough集理论的知识发现及数据仓库的决策支持研究[D].广西大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[43]张海滨.农业政策性金融对农产品加工企业的金融支持问题研究[D].安徽大学,工商管理,2012,硕士.
[44]刘鹏.生态学马克思主义视阈下的中国生态价值导向[D].吉林大学,国外马克思主义研究,2014,硕士.
[45]蒋蓉.从目的论的角度透视新闻翻译[D].安徽大学,英语语言文学,2013,硕士.
[46]吴义杰,高德群,谢美云,杨德洲.储层综合描述技术在江苏XWZ地区复杂断块群的应用[J].石油地球物理勘探,2000,01:113-120.
[47]贾媛媛.农民工子女受教育权问题研究[D].郑州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[48]张菲菲.我国服务型政府建设过程中的公民参与研究[D].东北大学,行政管理,2010,硕士.
[49]沈立艳.新课程理念下地理课型创新研究[D].河北师范大学,学科教学,2013,硕士.
[50]杨杰.教师参与校本课程开发的积极性研究[D].湖南师范大学,课程与教学论,2013,硕士.