新型高效糖化酶的获得及其酶学性质研究

【摘要】糖化酶的全称为葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase,EC.3.2.1.3)，它能水解淀粉、糊精、糖原等碳水化合物非还原末端的α-1,4葡萄糖苷键，并产生β-D-葡萄糖，同时也能缓慢水解α-1,6葡萄糖苷键和α-1,3葡萄糖苷键。真菌产的糖化酶主要分为两种类型，即I型糖化酶和II型糖化酶。I型糖化酶具有生淀粉结合域，O-连接和催化结构域，能够与生淀粉结合从而快速的水解淀粉；II型糖化酶缺少生淀粉结合域，不能或者只能缓慢水解生淀粉。工业上生产糖化酶的主要菌种有：黑曲霉(Aspergillusniger)，泡盛曲霉(Asperillusawamori)和米根霉(Rhizopusoryzae)。本实验室保藏的两株高产糖化酶菌株：黑曲霉A和黑曲霉B。黑曲霉A产生的糖化酶（以下简称GAA），其分子量约为116.0kDa，高效降解长链淀粉及糊化淀粉；黑曲霉B由来的糖化酶（以下简称GAB），其分子量约为76.0kDa，高效水解糊精及小分子寡糖。本研究以获得综合以上二者优秀特质的、新型高效糖化酶为目标，主要开展了以下三方面的工作：1.黑曲霉产糖化酶发酵数学模型的建立本研究首先根据5L发酵罐下的黑曲霉发酵数据，使用Logistic方程和Leudeking-Piret方程建立了黑曲霉发酵的生物量增长模型，产物合成模型和基质消耗模型。利用这些模型确定了发酵的对数期和稳定期，对数期的菌体适合用于制备原生质体，而稳定末期的发酵液能够获得最多的糖化酶。因此，这部分研究为后续的原生质体制备和糖化酶的获得奠定了基础。2.新型高效糖化酶生产菌的原生质体融合育种初探接着，以获得新型高效糖化酶为目的，进行了黑曲霉原生质体融合育种。将黑曲霉A和黑曲霉B进行融合。为此，首先探究了制备原生质体的最佳条件，并采用正交实验法来获得破壁酶的最佳配比。按照上述方法在获得具有活性且浓度足够的原生质体后，两个亲本原生质体分别经过碘代乙酰胺(IOA)和两性霉素B(AmpB)灭活后，使用30%PEG-3350作为融合剂进行原生质体融合，并在显微镜下观察到了融合子。将融合子涂布于高渗平板，由于代谢途径互补，能在平板上生长的就是融合子。通过上述实验，本文建立了产糖化酶黑曲霉原生质体制备和融合的方法，以及简单筛选融合子的方法。3.新型高效糖化酶的获得及其酶学性质研究随后，本研究开展了高效高转化率糖化酶获得的研究。通过对GAA和GAB进行复配来提高糖化酶的效率和转化率。使用生化层析技术分别将GAA和GAB纯化。纯化后的GAA和GAB通过不同比例的复配后测量其酶活力，T检验分析表明，GAB含量为40%，50%，60%和70%的实验组酶活力有显著提高，其中GAB含量为50%时酶活力提高的最多，约8%。因此将GAA和GAB按照酶活比例1:1的混合组称之为GAA&GAB，作为复配酶的代表进行后续实验。接着研究了三者（GAA，GAB和GAA&GAB）的最适温度和pH以及温度稳定性和pH耐受性。发现GAA，GAB和复配酶（GAA&GAB）的最适反应温度（60-65℃）和pH（3.9-4.9）相差不大，三者的温度稳定性和pH耐受性十分相似。随后进行水解糊精实验，并对反应液进行HPLC分析。研究发现三者在水解糊精过程葡萄糖含量一直上升，二糖和三糖含量先上升后下降。GAA，GAB和GAA&GAB水解糊精能力相似，其中，GAB最高，GAA&GAB次之，但是相差不大，GAA最低。同时HPLC分析发现，GAB水解二糖和三糖的能力最强。糖化酶水解玉米淀粉实验发现GAA和GAA&GAB水解玉米淀粉能力相似，但也有不同，即GAA是先快后慢，而GAA&GAB是先慢后快，GAB水解玉米淀粉能力最弱。上述实验表明，复配后的糖化酶无论在水解糊精还是水解玉米时，都表现出高效率和高转化率的特性。本文建立了黑曲霉发酵产糖化酶的数学模型并进行了仿真分析，为实际生产奠定了一定基础；成功建立了双亲灭活筛选黑曲霉融合子的方法，简单有效；通过将两种糖化酶进行复配，得打了新型高效的糖化酶，酶活力提高了8%，在水解糊精和淀粉时表现出新特性。本研究对糖化酶的工业应用具有指导意义，为高效糖化酶生产菌株的筛选提供了新思路。
【作者】占乐；
【导师】相宏宇；
【作者基本信息】吉林大学，生物工程，2014，硕士
【关键词】糖化酶；酶学性质；原生质体融合育种；复配酶；

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