以PTP1B为靶点的降糖药物筛选

【摘要】糖尿病（DM）是一种由于胰岛素缺乏或胰岛素功能缺陷所致慢性疾病，其伴随着一系列代谢紊乱。DM的患病率在全球不断增加。据国际糖尿病联合会（IDF）的最新统计数据，截止到2013年，全球有3.82亿人患有糖尿病，预计到2035年，这一数字将上升至5.92亿。2型糖尿病（T2DM）是糖尿病中最常见的形式，大约占全世界糖尿病的90％左右，其特点是高血糖症，血脂异常，以及代谢靶组织的胰岛素抵抗。2型糖尿病可导致严重的并发症，包括肾功能衰竭，失明，缓慢的伤口愈合和心血管疾病等。蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP），调节细胞内诸多依赖酪氨酸磷酸化的关键生理过程，在代谢中起重要作用。已在许多人类疾病中都发现了PTP活性的失常。PTP1B是从人胎盘中第一个被成功分离和表征的PTP超家族成员，其分子量大约为50kDa（435个氨基酸），它包含一个高度保守的催化基序，其中的Cys215和Arg221是对其磷酸酶催化活性至关重要的。PTP1B是胰岛素信号转导通路中关键的负调节蛋白，其作用通过阻断胰岛素刺激的胰岛素受体（IR）的酪氨酸磷酸化，进而影响胰岛素受体（IRS-1）的磷酸化和其下游通路。通常情况下，胰岛素触发一系列磷酸化事件的级联放大，开始于IR上多个酪氨酸残基的自磷酸化，提高了IR的激酶活性，并导致其招募IRS-1而使之活化，接着激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），蛋白激酶B（PKB，也称为AKT），最后激活葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）与细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）。激活GLUT4可以转运到细胞膜，从而影响葡萄糖的摄取；磷酸化的ERK1/2可以进入细胞核，影响基因的表达和翻译。PTP1B过表达或其酶活性的增加被发现存在于胰岛素抵抗和肥胖患者中。PTP1B基因敲除的小鼠是健康的，表现出胰岛素敏感性的提高，而且在高脂饮食的诱导下小鼠不发展为2型糖尿病和肥胖症。相当大的兴趣在增长以PTP1B作为治疗糖尿病和肥胖症的靶点。厚朴是中国传统医药，多年来被用于治疗各种疾病，包括焦虑症，神经紊乱，“肝郁气滞”（低能耗），哮喘和消化等问题。然而，它的降糖作用和机制在体内仍不明确。在我们的前期研究中，我们从重组的大肠杆菌细胞中分离纯化得到了人的PTP1B催化结构域。我们从多种中国传统药物提取物中体外筛选PTP1B的抑制剂。我们发现，厚朴提取物对PTP1B的抑制效果最佳，其IC50为55.96μg/ml。而且，厚朴提取物对PTP1B表现出良好的抑制选择性，对比其他的PTP家族成员，包括SHP1（IC50=501.94μg/ml），SHP2（IC50=521.56μg/ml），TCPTP（IC50=395.59μg/ml）和HePTP（IC50=677.88μg/ml）。酶动力学分析证实，厚朴提取物对PTP1B的抑制类型为可逆的竞争性抑制，其抑制剂常数（Ki）计算为0.049μg/ml。因此，厚朴提取物作为下一步的研究对象，研究其降糖作用。为了确认厚朴提取物是否发生在细胞水平上对PTP1B保持抑制效果，我们用不同浓度厚朴提取物刺激成熟的3T3-L1脂肪细胞和C2C12肌管细胞。我们发现，厚朴提取物能够增加细胞内总蛋白的酪氨酸磷酸化，并存在剂量依赖的效应。而且，厚朴提取物能够增强胰岛素刺激的IRβ和ERK1/2的酪氨酸磷酸化水平，并存在剂量依赖的效应，且不改变其蛋白水平。厚朴提取物还能增强胰岛素刺激的GLUT4向细胞膜的转运，并呈剂量依赖性作用。以上这些结果显示厚朴提取物通过抑制PTP1B的活性来改善胰岛素敏感性，并激活下游信号传导通路，例如ERK1/2的磷酸化和GLUT4转运。为了进一步探讨厚朴提取物的降血糖功效，我们用db/db小鼠（胰岛素抵抗和严重的高血糖）作为2型糖尿病的模型。db/db小鼠每天口服给药—0.5g/kg厚朴提取物，持续5周，其空腹血糖水平与糖尿病对照组小鼠相比明显降低。为了探索厚朴提取物的潜在毒性，我们用不同剂量的厚朴提取物一次性给昆明小鼠口服给药，在给药后观察小鼠的生理状态及死亡数目。我们计算其半数致死量初步评估厚朴提取物的急性毒性，其半数致死量与95％置信度（LD50=2.0±0.2g/kg），这表明厚朴提取物的毒性极小且耐受性良好。最后，我们得出结论，厚朴提取物通过对PTP1B专一的竞争性抑制作用，增强胰岛素信号通路转导，进而促进GLUT4向细胞膜的转运，从而降低db/db小鼠的血糖水平。我们的实验结果证实了厚朴提取物在以PTP1B的为靶点的抗2型糖尿病药物开发中潜力。
【作者】王永森；
【导师】付学奇；
【作者基本信息】吉林大学，生物工程，2014，硕士
【关键词】厚朴提取物；PTP1B；抑制剂；2型糖尿病；db/db小鼠；

【参考文献】
[1]白旭琴.晋西北根据地抗战勤务问题研究[D].山西师范大学,中国近现代史,2013,硕士.
[2]李禹函.广东省纺织品进出口公司关键岗位招聘方案优化研究[D].吉林大学,工商管理,2014,硕士.
[3]李爱春.不同快速降体重量对肌肉功能的影响[D].湖南师范大学,运动人体科学,2004,硕士.
[4]王俊华,左祥麟,左万利.基于证据理论的单词语义相似度度量[J].自动化学报,2015,06:1173-1186.
[5]李秋荣.高校突发事件新闻应对策略研究[D].华中科技大学,新闻学,2013,硕士.
[6]严慧颖.商都二叠纪大南坊子和二道洼花岗岩年代学及地球化学研究[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2014,硕士.
[7]雷祺.消费者需求的识别与培育研究[D].广西大学,2004.
[8]冯珺.《鄂尔多斯婚礼》品牌及其效益研究[D].内蒙古师范大学,中国少数民族经济,2013,硕士.
[9]于良杰.来华留学生汉语写作策略调查与分析[D].安徽大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[10]王涛.基于ARM的声源定位技术研究[D].沈阳航空航天大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[11]谭冬梅.小鼠囊胚体外着床三维模型的建立[D].重庆医科大学,生物医学工程,2004,硕士.
[12]陈薏妃.江门市蓬江区义务教育均衡发展研究[D].华南理工大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[13]赵晶.基于CGE模型的供水投资对经济影响分析[D].东北农业大学,农业水土工程,2013,硕士.
[14]张迪.基于Android煤矿安全生产移动监测系统设计与实现[D].西安科技大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[15]李龙婷.涡轮S_2流面计算损失模型修正及气动优化设计[D].哈尔滨工业大学,动力机械及工程,2013,硕士.
[16]魏崴.模块化神经网络中的若干问题研究[D].武汉理工大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[17]叶蔚嫦.桥梁板式橡胶支座剪切模量检测方法研究及抗压弹性模量测试系统刚度分析[D].浙江工业大学,2005.
[18]牛燕华.分析思维对决策中情绪预测偏差的影响研究[D].鲁东大学,应用心理（专业学位）,2014,硕士.
[19]周晖.基于超级电容器的石墨烯—氢氧化物复合材料制备、性能及机理研究[D].南京理工大学,2013.
[20]孙利.基于CRM的XT人寿保险公司营销模型研究[D].西北大学,2003.
[21]任鹏辉.基于DSP的信息共享式微机线路保护的研究[D].华北电力大学（河北）,电力系统及其自动化,2004,硕士.
[22]赵欣月.160000m~3LNG储罐混凝土外罐的地震响应分析[D].哈尔滨工业大学,结构工程,2013,硕士.
[23]檀林.模糊知识处理在中文文本自动分类中的应用研究[D].山西大学,2004.
[24]井方方.胰腺实性假乳头状瘤的临床特点与诊断治疗分析[D].青海大学,内科学,2014,硕士.
[25]徐凯.永磁体/压电复合器件的磁电特性研究[D].宁波大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[26]荆龙.鼠笼式异步风力发电机的优化控制[D].北京交通大学,2008.
[27]李璐.从非语言交际视角看中法文化之差异[D].浙江大学,法语语言文学,2013,硕士.
[28]丁俊香.一种基于理想可流动成型导电橡胶的三维柔性触觉阵列传感器若干问题的研究[D].中国科学技术大学,2011.
[29]谭智敏.人早幼粒白血病细胞穿过脑微血管内皮细胞单层需要p160～（ROCK）激酶的去活化[D].中国医科大学,发育生物学,2004,硕士.
[30]李宗伟.微生物燃料电池资源化处理含铜废水研究[D].西安建筑科技大学,环境工程,2013,硕士.
[31]渠岸杉,黄理灿,陈卫东,潘云鹤.e-Science技术综述[J].计算机测量与控制,2003,09:641-647.
[32]盛开俊.山东省高校体育教育专业乒乓球专选人才培养方式的研究[D].首都体育学院,运动训练,2013,硕士.
[33]张宏娜.β-二酮类衍生配体及其过渡/稀土金属配合物的合成、晶体结构及性质研究[D].西北大学,物理化学,2013,硕士.
[34]任晴.从目的论看《凤还巢》英译本隐喻翻译[D].燕山大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[35]单亚东.中国现代文学中的南京形象研究（1912-1949）[D].南京师范大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[36]逯珍花.玉葡萄根化学成分及质量控制指标的研究[D].云南中医学院,中药学,2012,硕士.
[37]张勤俭.强化大学职能实现高校跨越式发展[J].江西理工大学学报,2014,02:61-63.
[38]尹昌兰.对50周市电干扰的初步认识[J].石油地球物理勘探,1979,03:47-52.
[39]孙英敏.对无形资产转让定价国际税法规制的解析[D].吉林大学,国际法,2013,硕士.
[40]陈瑞峰.富勒烯碳纳米管[J].化学工业,2013,10:26-28.
[41]彭焕文.基于RTS2的自动DIMM系统的实现[D].中国科学院研究生院（云南天文台）,天文技术与方法,2014,硕士.
[42]迈尔哈巴?谢然甫.柬埔寨华校学生汉字书写偏误调查及分析[D].华中师范大学,对外汉语教学,2014,硕士.
[43]王伟博.不同水稻品种的碳代谢特性及相关性状的关联分析[D].浙江大学,生物物理学,2013,硕士.
[44]郝珍珍.基于ARM7大屏幕LED设计[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2013,硕士.
[45]杨新武,刘椿年.一阶规则获取中的等价类问题[J].计算机工程与应用,2003,18:58-60+79.
[46]李红艳.临澧县县域经济发展研究[D].江西农业大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[47]孙淑艳,谢刚,姜蕾,朱剑兵.多属性综合判识三角洲亚相方法——以临南洼陷双丰三角洲为例[J].石油地球物理勘探,2009,01:81-86+130+2.
[48]张妙静,张波,刘继宏,厉光烈.贫金属星的表面丰度与慢中子俘获过程[J].高能物理与核物理,2003,04:304-308.
[49]李铁安.基于无线技术的点餐系统设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[50]张琳.兴业银行泉州分行私人银行业务发展对策研究[D].华侨大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.