拟南芥DNA复制因子RFC1在减数分裂重组中的功能研究

【摘要】减数分裂是所有真核生物有性生殖所必需的一个生命过程,其目的是使同源染色体之间发生重组和交换,同源重组是生物多样性形成和遗传育种的基础。减数分裂的重组包括DNA的断裂、加工、合成和连接,DNA合成不仅是重组中非常重要的环节,也是生长发育所必需的过程,以致相关基因的缺失往往导致胚胎死亡。迄今为止,DNA合成相关基因在减数分裂重组环节中的功能还未有报道。此外,当前减数分裂重组模型中只包括了DNA前导链合成,至于是否需要DNA后随链的合成更不清楚。本论文采用减数分裂特异的基因沉默技术,T-DNA插入导致的弱突变材料,分子遗传方法,及细胞生物学等技术,详细研究了拟南芥DNA复制因子RFC1在减数分裂中的功能。主要结果如下：RFC蛋白复合物包括五个亚基。RFC1是其中最大的一个亚基,编码一个具有ATPase结构域的蛋白质。系统发育树分析表明RFC1是真核生物中高度保守的单拷贝基因,暗示其功能很保守。利用定量PCR技术分析RFC1在不同组织中的表达模式发现,RFC1是一个组成型表达的基因,在花中表达量较高。原位杂交试验进一步证明RFC1在减数分裂细胞的表达要高于周围体细胞,表明RFC1在减数分裂中可能具有重要功能。RFC1突变显著降低了植物的育性、减少了同源二价体的数目、出现非同源染色体间的相互作用、形成一些多价体、导致染色体的分离异常,并伴有染色体碎片的产生。利用减数分裂特异启动子DMC1降低RFC1的表达量,转基因DMC1-RFCIRNAi植物表现出类似rfc1-2突变体的表型；rfc1-2+/-杂合自交后代遗传分析表明rfc1-2突变体的表型是由单基因突变造成。此外,过量表达AtRFCl能够回复rfc1-2突变体减数分裂缺陷的表型,进一步表明rfc1-2突变体减数分裂异常的表型是由RFC1的突变所导致。减数分裂前期Ⅰ的核心事件是同源染色体之间的相互作用,包括配对、联会和重组。端粒聚集在核膜周围被认为对染色体早期配对有促进作用,可作为检测的标志。本研究利用端粒探针和染色体特异的BAC探针进行染色体原位杂交(FISH),发现端粒的聚集结构在突变体中没有明显异常,但是在粗线期能够检测到明显的非同源染色体配对。通过观察联会复合体的侧向元件(ASY1)和中央元件(ZYP1)蛋白质在野生型和突变体中染色体上的分布,发现突变体的染色体中出现局部不联会现象。减数分裂重组起始于拓扑异构酶SPO11切割的断裂双链,通过对比分析rfc1-2和rfcl-2spoll-1的减数分裂表型,表明rfc1-2中的多价体和染色体碎片完全依赖于SPO11-1。进一步遗传分析RFC1与单链结合蛋白RAD51之间相互关系,表明RFC1位于RAD51的下游。免疫荧光试验也证明,细线期到偶线期rfc1-2突变体中RAD51的信号数目与野生型之间没有显著差异,但是在粗线期信号分布有所滞后,暗示突变中DSB的修复可能相对推迟。减数分裂重组的修复形成交换和非交换,交换通道主要包括MSH4和PTD等介导的主要通道-干涉敏感性交换；MUS81介导的干涉不敏感性交换。通过对比分析rfcl-2与rfc1-2msh-1、rfc1-2ptd-1、rfc1-2mus81-1的减数分裂表型,表明RFC1主要作用于干涉敏感性交换途径,其突变体中的多价体和少量活性花粉完全依赖于MUS81。rfc1-2突变体中有少量的活性花粉,本研究利用转基因植物带有不同荧光标记的FTL系统,通过观察花粉中的不同荧光颜色,推测其发生的重组情况。结果表明,相比于野生型,rfc1-2突变体中的重组分布在重组发生较高的区域有所下降,而在重组发生较低的区域有所增加。此外,rfc1-2突变体中CO表现出干涉不敏感。由于RFCl是DNA后随链合成所必需的主要因子之一,且在真核生物中非常保守。由此推测,减数分裂重组的主要通道干涉敏感性途径需要DNA后随链合成的这一机制在真核生物中可能非常保守。因此,该研究结果不仅能够为农作物分子育种提供指导,还可以为人类生殖健康提供借鉴。
【作者】程志号；
【导师】马红；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2013，博士
【关键词】减数分裂；DNA复制因子；干涉敏感型交叉；后随链合成；

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