干旱对水稻花发育的影响：形态学，转录组学及相关基因的功能研究

【摘要】干旱胁迫严重降低农作物,尤其是谷类作物的产量。在生殖发育时期遭遇干旱胁迫,农作物产量受到的影响最为严重,然而干旱造成生殖发育缺陷及其分子水平的变化目前所知甚少。本论文,通过对生殖期受到干旱胁迫的水稻花形态学观察和转录组的研究,探索干旱影响花发育的分子机制,并试图找到控制干旱胁迫下花发育的基因。本文的实验结果显示,干旱胁迫降低了花粉粒的育性,在同一个穗中,不同时期的花的育性受到不同程度的影响。同时,干旱胁迫导致淀粉粒在花药中积累的位置和数量上发生异常。干旱胁迫条件下,不同发育时期(2-3mm、3-4mm、4-5mm和5-7mm)的花的转录组分析发现1600多个干旱应答基因,其中大多数基因的表达只在一或两个发育时期发生变化,说明不同发育时期的花调动不同的基因来应对干旱胁迫。这些干旱应答基因中包括发育调控的基因,例如主要在绒毡层或者小孢子里特异表达的基因在花粉粒成熟期受到明显的影响,这些基因功能可能与花粉壁的形成、细胞壁扩张、离子运输和淀粉合成相关。花发育相关的减数分裂和MADS-box基因没有明显变化。同时,碳水化合物代谢,GA信号途径和ABA信号途径的基因得到富集。基因芯片分析的结果暗示：在干旱胁迫下,植物激素、淀粉合成等途径和花发育过程发生了复杂的相互作用。本研究增加了对干旱胁迫下生殖发育过程的认识,并发现了一些可能在此过程中起关键作用的候选基因。通过转录组分析,我们得到了1617个可能参与干旱胁迫下花发育的候选基因,对这些基因的功能注释和表达特异性的比较后,从中挑选了一批基因,我们得到这些基因相关的水稻和拟南芥的功能缺失和功能获得性突变体后进行表型观察,以期通过表型分析进一步验证这些基因的功能。实验结果发现：水稻3-OAC基因的缺失突变体花器官发育异常,其拟南芥中同源基因的缺失导致拟南芥对氯化钠超敏感；水稻CAO基因缺失突变体雌蕊和雄蕊数目不正常且花粉粒育性明显降低,其拟南芥中同源基因的缺失则对ABA超敏感；在拟南芥和水稻中过量表达OsPP2C都会造成植株对干旱超敏感,另外水稻突变体pp2c的叶片比野生型偏黄；水稻突变体msp的种子较野生型大。这些都值得进一步研究,同时也证明我们的芯片实验筛出的基因是可靠的。在此过程中,我们发现编码转录因子的基因OsERF过表达株系表现出对干旱的抗性,故选择OsERF基因作为进一步研究的重点。首先,根据AP2/EREBP基因家族的进化分析将OsERF命名为OsERF101。通过promoter-GUS报告系统、Insitu杂交和qRT-PCR检测表明,OsERF101在正常生长条件下的根、幼叶、老叶中无表达,在干旱胁迫后的老叶中有表达；OsERF101在早期和小孢子发育时期的花里表达,尤其在花药的绒毡层和小孢子细胞里表达水平较高,在小孢子发育后期表达量下降；在种子里无表达；OsERF101还受到PEG和ABA的诱导表达。过量表达OsERF101能够增强水稻苗期和生殖期的抗旱性,脯氨酸含量增加和过氧化物酶活性增高可能是其提高抗旱性的原因之一。OsERF101过表达的转基因植株在干旱胁迫下的花粉粒育性和结实率相比于野生型都得到了提高。通过检测干旱胁迫和花发育相关的已知基因的表达情况,发现OsERF101能够增加ABA应答基因的表达,说明OsERF101可能通过ABA依赖途径增强植株的抗旱性。另外,在正常的生长条件下,Oserf101突变体和RNAi植株育性都很低。仔细观察突变体和RNAi的花药发育过程后,发现有三种不同的花药类型,第一类是正常的花药；第二类为花药内侧没有花粉囊的异型花药；第三类是有正常花粉囊,但其中的小孢子发育不正常的异型花药。这表明OsERF101可能与花药的发育过程相关。更有趣的是,OsERF101是AP2/EREBP转录因子家族中的一个成员,但在正常生长条件下并没有定位于细胞核中,只有截去氨基端信号肽之后才能定位于细胞核中,所以我们推测OsERF101可能通过双向定位这种功能来完成对干旱胁迫下花药发育的调控,但这个推测还需要大量的实验来证实。
【作者】金越；
【导师】马红；葛晓春；
【作者基本信息】复旦大学，生物化学与分子生物学，2013，博士
【关键词】水稻；花发育；干旱胁迫；花药育性；转录组分析；OsERF；ABA；

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