Tfh和Breg细胞在系统性红斑狼疮发病中的作用及MSC对其调控研究

【摘要】研究背景系统性红斑狼疮(SLE)是一种累及全身多器官、多系统的慢性自身免疫性疾病,多发于育龄期妇女,我国的发病率远高于国外。SLE发病机制复杂,目前未完全阐明,但明确的是免疫系统的失调和紊乱参与了SLE的发病及后续的多系统累及。因此,深入揭示SLE发病的免疫学机制,对寻找新的治疗靶点和治疗方法,进一步提高SLE的临床治疗水平具有重要的意义。滤泡辅助T细胞(Tfh)是一群近年来发现的Th细胞,主要分泌IL-21,传统认为其功能以辅助效应性B细胞分化、成熟及分泌抗体为主,在自身免疫性疾病的发生发展中具有重要的作用,研究表明狼疮中Tfh细胞比例增加,但Tfh细胞的增加与狼疮病情活动的关系目前无相关报道。调节性B细胞(Breg)是一群具有免疫调节功能的B细胞,在胶原诱导性关节炎(CIA)、炎症性肠病(IBD)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)等动物模型中具有重要的免疫抑制作用。但Breg细胞在SLE中作用,目前研究结果不尽相同。狼疮体内Breg细胞的比例如何,与病情活动度有无相关性,且Tfh细胞是否对Breg细胞具有辅助作用,其可能的辅助机制如何,目前国内外尚无明确报道。此外,间充质干细胞(MSC)近年来作为狼疮治疗的新方法,在动物实验和临床中取得了初步的疗效,其作用机制主要通过分泌抑制性的细胞因子或细胞接触抑制发挥免疫调节作用,但MSC是否能通过调节Tfh和Breg细胞来发挥免疫调节作用目前无明确结论,有待进一步的研究。研究目的第一部分：明确SLE患者外周血中Tfh和Breg细胞比例的变化,分析Tfh和Breg细胞间的相关性,及与SLE病情活动的相关性；第二部分：探讨MRL/lpr狼疮鼠中Tfh和Breg细胞比例变化和狼疮病情活动的相关性；第三部分：明确Tfh细胞及其分泌的IL-21对Breg细胞分化的调控作用和机制；第四部分：明确MSC输注对MRL/lpr狼疮鼠的治疗作用,及对Tfh和Breg细胞的调节作用。研究内容与方法第一部分荧光显微镜下检测SLE患者外周血中是否存在Tfh和Breg细胞；免疫组化检测SLE皮损组织中IL-10阳性B细胞的浸润情况；流式细胞仪检测30例SLE患者和15例正常对照外周血中Tfh和Breg细胞的比例,并分析两者的相关性；实时定量RT-PCR(real-timeRT-PCR)检测Tfh和Breg细胞相关细胞因子和转录因子mRNA的表达；酶联免疫吸附实验(ELISA)检测SLE患者血清中IL-21、IL-10、ds-DNA和ANA的浓度；结合临床SLEDAI评分分析SLE中Tfh和Breg两群细胞间的相关性及与SLE病情活动的关系。第二部分流式细胞仪检测MRL/Ipr狼疮鼠脾细胞中Tfh和Breg细胞的比例；real-timeRT-PCR检测Tfh和Breg细胞相关细胞因子及转录因子mRNA的表达；ELISA检测外周血清中ds-DNA、ANA、IL-21、IL-10的浓度；免疫组化检测脾脏生发中心(GC)的变化,及IL-21和IL-10在脾脏中的表达；分析Tfh和Breg两群细胞间的相关性及与狼疮病情活动的关系。第三部分从小鼠脾细胞中分选Tfh细胞,体外培养后收集上清备用;分选小鼠脾脏NaiveB细胞,体外培养时加入上一步收集的Tfh细胞培养上清,继续培养2-3天后流式细胞仪检测Breg细胞的比例,ELISA检测上清中IL-10的浓度；IL-21体外直接作用于小鼠NaiveB细胞,研究IL-21对Breg细胞分化和IL-10分泌的影响；同时研究IL-21对Breg细胞分化过程中STAT3活化的影响,并通过阻断JAK和p-STAT3的活化,明确JAK-STAT3信号通路在IL-21介导的Breg细胞分化过程中的作用；并进一步研究IL-21诱导的Breg细胞的免疫抑制作用。第四部分体外全骨髓贴壁法分离B6鼠来源的MSC,经体外培养及纯化细胞至第四代(P4),流式细胞仪检测其表面的8种标志。MSC与脾细胞共培养后流式细胞仪检测MSC对Tfh和Breg细胞分化的影响,MSC与体外分选的CD4+T细胞及CD19+B细胞共培养,检测MSC的对T、B淋巴细胞中细胞因子和转录因子的调控。分离纯化的MSC经尾静脉注射入MRL/Ipr狼疮鼠体内,继续饲养8周后检测狼疮鼠的病情变化,流式细胞仪检测MSC输注治疗后MRL/Ipr狼疮鼠脾细胞中Tfh和Breg细胞比例的变化。研究结果第一部分1、SLE患者外周血中存在循环的Tfh和Breg细胞,两群细胞比例增多并呈正相关,SLE皮损中IL-10阳性的B细胞增加：2、SLE患者外周血中Tfh分泌的IL-21和Breg分泌的IL-10的基因表达和蛋白分泌都增加,IL-21不仅与自身抗体分泌相关,且与IL-10浓度的增加呈正相关。第二部分1、MRL/Ipr狼疮鼠脾脏增生明显,脾细胞中Tfh和Breg细胞的比例扩增,相关细胞因子和转录因子mRNA表达增加；2、脾脏中Tfh细胞不仅与生发中心形成、自身抗体分泌及狼疮发病相关,与Breg细胞的扩增也密切相关。第三部分1、Tfh细胞分泌的IL-21能促进Breg细胞的体外分化和IL-10的分泌；IL-21能以时间和剂量依赖的方式促进Breg细胞分化和IL-10的分泌；2、IL-21通过诱导STAT3的磷酸化进而促进Breg细胞的分化和IL-10的分泌,阻断JAK-STAT3信号通路能抑制IL-21介导的Breg细胞分泌IL-10；3、IL-21诱导的Breg细胞具有明确的免疫抑制作用。第四部分1、小鼠骨髓来源的MSC分离纯化到第四代时能获得较高纯度的MSC；2、MSC在体外能抑制Tfh和Breg细胞的分化；3、MSC治疗MRL/Ipr狼疮鼠后,能有效改善狼疮鼠的病情进展,抑制体内Tfh和Breg细胞的分化。研究结论1、SLE患者外周血中存在扩增的Tfh和Breg细胞,两群细胞比例增加并与SLE病情活动相关,Tfh细胞的多克隆与Breg细胞的扩增呈正相关；2、MRL/Ipr狼疮鼠中Tfh和Breg细胞比例增加,Tfh与Breg细胞的扩增呈正相关；3、Tfh细胞可通过分泌的IL-21诱导Breg细胞的分化和IL-10的分泌,IL-21可通过活化STAT3来促进Breg细胞的分化；4、MSC治疗能有效改善狼疮鼠的病情进展,MSC可通过抑制狼疮鼠体内的Tfh细胞发挥治疗作用,MSC对Breg细胞并无明显的促进作用。
【作者】杨雪；
【导师】邹和建；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】系统性红斑狼疮；滤泡辅助性T细胞；调节性B细胞；白细胞介素21；白细胞介素10；JAK-STAT3；骨髓间充质干细胞；

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